[发明专利]一种构建人单克隆抗体片段复合物的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物医学、基因工程和细胞工程及免疫学领域，尤其涉及一种构建人单克隆抗体片段复合物的方法。

背景技术

抗体类药物以其安全有效，特异性高的优点，已成为国际药品市场上的一大类新型的诊断和治疗剂。到目前为止，美国FDA已批准了24个抗体药物上市，全球有超过200家公司正在研发单抗治疗药物，约有360个产品正在研发之中，全球抗体类药物市场销售额在2000年时为17亿美元，2004年达103亿美元，预计到2010年全球市场将达300亿美元。目前国内抗体药物市场尚未形成，年销售额不足亿元。

由于鼠源性抗体不仅受到人体免疫系统的排斥，而且Fc片段不能有效地激活人体效应系统，所以用人抗体取代鼠抗体是克服鼠单抗在临床应用障碍的关键，而杂交瘤技术又不能提供稳定分泌人抗体的细胞株。随着基因工程技术的发展，为人源化抗体的研制提供了基础，特别是用人抗体恒区置换鼠抗体相应部位的人鼠嵌合抗体。这类抗体分子70％-90％为人源，在抗原特异性和亲和力方面都较好地保留了亲代抗体的特征，在体内的半衰期和效应功能也有所提高，但免疫源性降低了12％左右。完全人单克隆抗体则是最理想的选择。

目前，生产人抗体的方法主要包括抗体库技术和转基因小鼠技术，但这两类技术均尚处在实验室研发阶段，不够成熟，未见实际成功报道。

发明内容

本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种工艺合理、产品和抗原特异性结合优良的构建人单克隆抗体片段复合物的方法。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

一种构建人单克隆抗体片段复合物的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

(1)从人全血中分离B细胞，并从人微量B细胞中用RT-PCR方法扩增人抗体重链和轻链基因片段；

(2)从步骤(1)中获得的基因片段，分别克隆进表达载体pCABHCV和pCABLCV；

(3)用pCABHCV和pCABLCV双转化大肠杆菌JM109或BL21，人抗体重链和轻链片段表达后，同时分泌于培养液上清，并形成复合物，该复合物为人单克隆抗体片段复合物。

所述的步骤(1)具体包括以下分步骤：

(1)从人全血中分离B细胞及B细胞的保存

1)人全血预处理

EDTA或柠檬酸进行抗凝处理的人全血加入二倍体积的缓冲液(含有0.1％BSA，2mM EDTA的PBS缓冲液)离心后，去上清，在血细胞中加入等体积上述溶液混匀后，用于B细胞的分离；

2)人B细胞的分离

用包被抗CD19抗体的磁珠方法从人全血中分离人B细胞；

3)人B细胞的保存

分离得到的B细胞用冻存液(含10％胎牛血清，10％DMSO的DMEM)冻存于液氮中，该冻存方法至少在2年内可保持细胞膜及RNA的完整；

(2)集群引物来源和设计

1)搜寻γ重链及λ、κ轻链的基因序列

应用生物信息学的方法从基因库获得文献已报导的所有的人抗体的γ重链及λ、κ轻链的基因序列；

2)分拣，归类各γ重链及λ、κ轻链的基因序列

将上述搜索到的基因分类为γ、λ、κ三组基因序列，在各组序列中进行一系列对比，并将相似的序列进行兼并；

3)人抗体γ重链及λ、κ轻链的集群引物设计

由于是用微量的B细胞扩增人γ重链及λ、κ轻链的基因序列，所得到的模板的量十分稀少，因此设计了nest-PCR：即通过两次PCR的方法来扩增目的γ重链及λ、κ轻链的基因片段，为此设计了两组集群引物：

a.第一次PCR引物：长21bp，γ重链引物为18对，λ轻链引物为35对，κ轻链引物为33对；

b.第二次PCR引物：长49bp，在第一次PCR引物的基础上，5’引物加上AscI酶切位点及信号肽序列，3’引物向上游移动了20bp，形成巢式结构，并引入了NotI酶切位点，这使PCR效率及稳定性大为提高，减少了PCR反应的非特异性产物，并使所获得的人抗体的轻、重链功能性片段可直接进行克隆及表达；

(3)人B细胞中抗体相关基因的扩增

1)从10个人B细胞中获取微量mRNA

用裂解缓冲液(Lysis Buffer with Lysis Enhancer，Invitrogen公司)逐级稀释B细胞，准确地取10个B细胞，置于200微升薄壁PCR管中，并配置裂解反应体系，体系中含oligo-d(T)20 3.85uM及RNase OUT 3.08U，轻柔混合后，置PCR仪中75℃保温10分钟，立即插入冰中至完全冷却；