[发明专利]一种基于荧光通用引物的多重定量RT-PCR基因表达谱分析方法

权利要求书

1.一种基于荧光通用引物的多重定量RT-PCR基因表达谱分析方法，其特征在于：包括下列步骤：

(1)通用引物及上下游嵌合特异引物的引物序列设计

通用引物的长度为20bp，上游通用引物5’端用Fam荧光标记，嵌合特异引物长度为38bp，3’端为特异引物序列段，5’端为通用引物序列段；

(2)多重RT-PCR反应过程：

a逆转录反应阶段，下游嵌合特异引物逆转录合成目的基因的cDNA第一链；

b PCR反应过程，前3个循环，上游嵌合特异引物将通用引物序列加到目的基因DNA片段的两端；PCR反应的余下循环，高浓度的荧光通用引物取代上游嵌合特异引物完成整个PCR反应过程；

(3)测序仪凝胶电泳予以分析检测。

2.根据权利要求1所述的基于荧光通用引物的多重定量RT-PCR基因表达谱分析方法，其特征在于：步骤(1)中设计扩增产物的长度在100～400bp间，相邻产物长度差为5～7bp。

3.根据权利要求1所述的基于荧光通用引物的多重定量RT-PCR基因表达谱分析方法，其特征在于：步骤(1)中所述的通用引物为上下游同一序列。

4.根据权利要求1所述的基于荧光通用引物的多重定量RT-PCR基因表达谱分析方法，其特征在于：步骤(2)中所述的PCR反应过程，前期加入一个上游嵌合特异引物的降落式PCR过程，为11个循环。

5.根据权利要求1或2或3或4所述的基于荧光通用引物的多重定量RT-PCR基因表达谱分析方法，其特征在于：所述的通用引物根据水稻序列设计，引物序列为：FWD，5’-cgggctacgctatctacgac-3’，REV，5’-cgggcagtaagtaccgttgt-3’。

6.根据权利要求1或2或3所述的基于荧光通用引物的多重定量RT-PCR基因表达谱分析方法，其特征在于：所述的嵌合特异引物根据11个小鼠目的基因和3个看家基因的cDNA序列信息设计，引物序列为：

phf6  FWD：cgggctacgctatctacgacCGCAAAGGAAGACCGAGA

      REV：cgggcagtaagtaccgttgtTGGACCTGCTGTCTTCTGG     产物长度：98bp

Placl FWD：cgggctacgctatctacgacATCCGCATCAAGGCTGTC

      REV：cgggcagtaagtaccgttgtGATGAGCCCTTGGAAGCA      产物长度：114bp

Tmem32  FWD：cgggctacgctatctacgacCCCACGAGCATGAACACA

        REV：cgggcagtaagtaccgttgtAGGCGGGGTTCCTATCAA      产物长度：122bp

Usp26   FWD：cgggctacgctatctacgacATGCCCAGACACAGCACA

        REV：cgggcagtaagtaccgttgtTGACACCGAACCATTCCA      产物长度：138bp

Ddx26b  FWD：cgggctacgctatctacgacACGTGGCATTGAGGGAAA

        REV：cgggcagtaagtaccgttgtTCATGGAGGCGGACGTAT      产物长度：145bp

PPIA    FWD：cgggctacgctatctacgacACGCCACTGTCGCTTTTC

        REV：cgggcagtaagtaccgttgtTGCAAACAGCTCGAAGGA      产物长度：152bp

mospd1  FWD：cgggctacgctatctacgacTTCCGAGGAGCCAGTGTT

        REV：cgggcagtaagtaccgttgtTGGCACTGGATCCCACTT      产物长度：164bp

Hsbst2  FWD：cgggctacgctatctacgacTTCGGCCAGGTTTGTACC

        REV：cgggcagtaagtaccgttgtAGGTGACGGCCAAAAGTG      产物长度：178bp

Gm773   FWD：cgggctacgctatctacgacAACCACATCACGGCAGGT

        REV：cgggcagtaagtaccgttgtTCCAGGAAAGCCATTTGC      产物长度：187bp

Mbnl3   FWD：cgggctacgctatctacgacTGGGCGTGGAGACAGTTT

        REV：cgggcagtaagtaccgttgtGGCCTGACTTT TGCCAGA      产物长度：197bp

Gapdh   FWD：cgggctacgctatctacgacCAATGTGTCCGTCGTGGA

        REV：cgggcagtaagtaccgttgtGGCATCGAAGGTGGAAGA      产物长度：218bp

FhI1    FWD：cgggctacgctatctacgacCAGGTGCAAAGGGTGCTT

        REV：cgggcagtaagtaccgttgtTGGCCTTGTTGCACTTCA      产物长度：249bp

Cxxlb/Cxxla    FWD：cgggctacgctatctacgacATGGCGAGATGGACAAGC

               REV：cgggcagtaagtaccgttgtCGAACACCCGCTTCATCT  产物长度：256bp

Beta-actin  FWD：cgggctacgctatctacgacCAACTGGGACGACATGgA

            REV：cgggcagtaagtaccgttgtCCATCACAATGCCTGTGG  产物长度：270bp