[发明专利]双色单光子横向超分辨成像的方法和装置

说明书

技术领域

本发明与生物医学有关，涉及双色单光子荧光成像，特别是一种双色单光子横向超分辨成像的方法和装置，以适用于医学生物组织的检测。 

背景技术

长期以来，远场光学荧光显微镜凭借其非接触、无损伤、可探测样品内部等优点，一直是生命科学中最常用的观测工具。但由于衍射极限的存在，使传统的宽场光学显微镜横向分辨率仅约为200nm。为了揭示细胞内分子尺度的动态和结构特征，提高光学显微镜分辨率成为生命科学发展的迫切要求。在远场荧光显微镜的基础上，科学家们已经发展出一些实用的提高分辨率甚至超越分辨率极限的成像技术。例如，采用横向结构光照明，提高横向分辨率到约100nm，这种技术需要复杂的解码处理，耗费时间。受激荧光损耗显微镜利用非线性效应实现了30-50nm的三维分辨率。应用荧光分子之间能量转移共振原理以及单荧光分子定位技术也可以突破衍射极限，但这些技术往往需要非常苛刻的条件和昂贵的设备，过程也十分复杂。 

近年来，光敏荧光蛋白作为一类新的荧光探针分子吸引了科研工作者们的广泛关注，这类荧光蛋白与普通荧光蛋白最大的不同之处是：通过一束特定波长的光敏化之后，才能够被激发发射荧光，或者极大地增强原有的荧光，直至漂白。换言之，光敏荧光蛋白需要两种不同波长的光共同作用才能激发荧光(参见George H.Patterson et al.，Science，vol.297，1873-1877，2000)。如今，这种荧光分子被应用于细胞内物质追踪等领域的研究。在光敏荧光蛋白中，有一种非常特殊的荧光蛋白称为可逆光敏荧光蛋白，这种可逆敏化蛋白相对于一般光敏荧光蛋白的独特性质表现在：漂白之后可以通过一束恢复光使荧光蛋白重新恢复到可激发态。例如：Dronpa，KFP1(kindling fluorescent protein-1)(以上两种可逆荧光蛋白暂无中文名称，市场上有商品)等。以下具体以Dronpa为例，它在405nm光照射下敏化，488nm照射下激发荧光，进入暂时的漂白，接着再次用405nm光照射，Dronpa将再次从漂白中恢复，敏化-激发-漂白-恢复这一循环可重复达上百次(参见Ryoko Andoet al.，Science，vol.306，1370-1373，2004)。在敏化光光强不太大的情况下，荧光强度与敏化光强度近似呈线性关系(参见Peter Dedecker et al.，BiophysicalLetters，vol.91，45-47，2006)。不难发现，Dronpa的敏化激发过程虽然需要两种波长的光，但直接激发荧光的只是其中一种波长的光，即488nm激发光，因此实质上是一种双色单光子的线性过程，相对于双色双光子非线性吸收过程效率有极大的提高。另外由于Dronpa敏化前无法激发荧光，可以有效抑制敏化光和激发光非重叠区域的背景噪声，可反复激发的特性使得它可能用于扫描成像。 

发明内容 

本发明要解决的技术问题在于克服上述现有技术对生物组织横向分辨率不足的问题，提供了一种双色单光子横向超分辨成像的方法和装置，该发明可提高生物组织中成像的横向分辨率。 

本发明技术解决方案如下： 

一种双色单光子横向超分辨成像的方法，其特点是采用两束激光分别作为敏化光和激发光，利用聚焦后两束光的点扩散函数重叠部分同时敏化和激发被可逆光敏荧光蛋白分子标记的样品，被激发的荧光信号通过陷波滤光片和长通滤光片过滤由聚焦透镜聚焦，经过一个小孔光阑滤除背景噪声被雪崩二极管收集，计算机记录荧光信号强度数值后关闭快门阻挡所述的激发光，使所述样品上的可逆荧光蛋白分子在敏化光的作用下恢复到可激发态，每测量完所述样品的一个测量点后，计算机驱动三维平移台移动所述的的样品至下一个待测量点，所述的快门在计算机的控制下再次打开，重复上述测量过程，计算机依次获取所述的样品的所有测量点的荧光信号强度值，然后由计算机根据所采集的所有测量点的荧光信号强度值按几何位置排列重构，获得所述的样品的三维图像。 

在敏化光强度不太高的情况下，荧光强度与敏化光强呈线性关系。所述的激发光所产生的荧光与所述的敏化光强和激发光强的关系处于线性区。 

一种双色单光子横向超分辨的成像装置，其特点在于该装置包括照明部分、探测收集部分和扫描部分：