[发明专利]一种肽用于调控奶牛瘤胃发酵的体外应用及检测方法

权利要求书

1.一种肽用于调控奶牛瘤胃发酵的体外的检测方法，其特征在于它包括以下步 骤：

(1)人工瘤胃模拟装置：用内径为32mm，长200mm，刻度体积为100ml的 医用注射器作为发酵器，用可以精确控温±0.5℃的水浴摇床作为控温装置；

(2)人工瘤胃缓冲液的配制：取得瘤胃液以后加入混合培养液：400ml蒸馏水 +0.1ml微量元素溶液+200ml缓冲溶液+200ml常量元素溶液+1ml刃天青溶液 +40ml还原剂溶液，并混匀，加热至39℃，同时使用CO₂饱和；其中微量元素 溶液：13.2g CaCl₂·2H₂O、10.0g MnCl₂·4H₂O、1.0g CoCl₂·6H₂O、8.0g FeCl₃·6H₂O 和蒸馏水至100ml；缓冲溶液：4.0g NH₄HCO₃、35g NaHCO₃和蒸馏水至1000ml； 常量元素：5.7g Na₂HPO₄、6.2g KH₂PO₄、0.6g MgSO₄·7H₂O和蒸馏水至1000ml； 刃天青溶液：0.1％w/v；还原剂溶液：4.0ml NaOH、625.0mg Na₂S·9H₂O、蒸 馏水95ml；每个注射器吸入瘤胃液与缓冲液1∶2混合液共30ml；

(3)在瘤胃微生物培养液发酵管中添加肽，各处理组均按氨基氮：淀粉为1∶ 4.5的比例添加玉米淀粉作为微生物生长能源，每个处理组设发酵2h、4h、6h、 8h、12h、24h、48h共七个时间点用于采样，每个时间点设三个重复，每个重复 一支发酵管；在各时间点测定发酵管内发酵液的产气量、pH值、氨氮浓度、VFA 浓度和MCP的产量；

(4)人工瘤胃液的采集：在试验奶牛晨饲2h后，分别从每头牛瘤胃中抽取 300ml瘤胃液，混合，用4层精细纱布过滤，灌入到预热达39℃并始终通有CO₂的保温瓶中；

(5)体外产气量的测定：每个注射器吸入瘤胃液与培养液的混合液后用自制 的堵头密封保持厌氧，记录活塞的位置；注射器在39℃水浴，在48小时内读取 活塞位置，计数点为2h、4h、6h、8h、24h、48h；用计数点活塞位置减去活塞 的初始位置，即为在相应时间内饲料发酵的产气量；

(6)瘤胃发酵液pH值的测定：发酵物样品被采集后，采用Sartorius PB-20型 酸度计对发酵物样品进行pH值测定；

(7)瘤胃发酵液氨氮浓度的测定：采用试剂均为分析纯，所用水为蒸馏水或 去离子水：

试剂包括：A液：苯酚显色剂(1L)

1)称取0.05g亚硝基铁氰化钠(Na₂Fe(CN)₅NO·2H₂O)溶解于0.5L蒸馏水中；

2)称取10g干燥苯酚(C₆H₅OH)，移入1L的容量瓶中，用蒸馏水定容至1L；

3)将上述1L的溶液小心移入棕色瓶内，在2～10℃下避光保存，保质期6个月；

B液：次氯酸盐试剂(1L)

1)5g氢氧化钠(NaOH)溶于烧杯中，加入600ml蒸馏水；

2)37.85g磷酸氢二钠(Na₂HPO₄·7H₂O)适当加热溶解摇匀；

3)冷却后，加入100ml次氯酸钠混匀；

4)蒸馏水定容至1L；

5)1#滤纸过滤后，在2～10℃下，避光保存于聚乙烯瓶中，保质期6个月；

氨标准溶液：

1)贮备液为32mg/dl；

2)1.0045gNH₄Cl溶于800ml去氨蒸馏水中；

3)用稀释的盐酸滴定至pH值为2；

41蒸馏水定容至1L；

5)用贮备液配制以下溶液：32，16，8，4，2，1，0mg/dl标准溶液；

(8)瘤胃液样品采集：

1)用两层精细纱布过滤瘤胃液；

2)加入2ml新配制的25％偏磷酸于8ml两层纱布过滤的瘤胃液中，封盖，摇匀；

3)若不立即测定在-20℃保存；

4)分析前在11～12,000rpm下离心20min，上清液用于分析；

测定步骤：

1)漩涡振荡上清液；

2)用“Digifiex”自动进样器，吸取40μl瘤胃液或标准液加40μl蒸馏水至贴好 标签的试管中，同时设重复；

3)吸取A液2.5ml加入每个试管，漩涡振荡；

4)吸取B液2.0ml加入每个试管，漩涡振荡；

5)在37℃水浴中加热30min；

6)550nm下读数；若显色太重，用较小的波长测定，或将样品用蒸馏水1∶1稀释；

7)用线性回归估测标准曲线；

8)吸收值代入方程，对于瘤胃液NH₃-N，计算结果*1.25校正偏磷酸误差；

(9)瘤胃发酵液VFA浓度的测定：试验中所用试剂均为分析纯，所用水为蒸 馏水或去离子水；

岛津GC-2010型气相色谱仪，气相色谱条件：柱箱温度120℃、色谱柱为长 30m，内径0.22mm，薄膜厚度0.25μm的中极性毛细管柱、SPL230℃、压力 97.7kPa、氢气流量40ml/min、空气流量400ml/min、FID240℃；采用外标法， 配制一系列已知浓度的色谱标准酸；样品注入量为1μl，即将乙酸400μl，丙酸 400μl和丁酸200μl用超纯水定容至100ml，然后用气相色潜仪绘制色谱图， 计算各酸的保留时间和峰面积，按单点法将样品测定结果-峰面积值换算成各挥 发性脂肪酸的摩尔浓度(mmol/L)；

样品处理：取四层纱布过滤的瘤胃液5mL，10000g离心10min；移取上清 液1mL至小离心管中，并加入冰后的25％的偏磷酸0.25mL，静置30min；然后 10000g离心15min，取上清液直接进行测定；

(10)瘤胃发酵液中微生物蛋白MCP的测定：量取50mL经4层纱布过滤的 瘤胃液，于39℃下150g离心5min；准确量取30mL上清液于4℃下20000g离 心20min，沉淀加入30mL蒸馏水轻轻摇动溶解后于4℃下20000g离心20min， 沉淀经生理盐水和蒸馏水冲洗后再重复加入蒸馏水离心一次，以充分消除饲料氮 源后，收集细菌沉淀备用，将上述高速离心收集的细菌沉淀小心无损地转移到消 化管中，按凯氏微量定氮法常规测定。