[发明专利]一种功能菌群在水处理系统中稳定性的检测方法

权利要求书

1、一种功能菌群在水处理系统中稳定性的检测方法，其特征在于功能菌群在水处理系统中稳定性按以下步骤进行检测：一、提取生物水处理系统中微生物基因组总DNA；二、用16s rDNA V3区通用引物进行PCR扩增；三、PCR产物与水处理系统功能菌群标准样品同步进行DGGE分析，即得出检测结果；其中步骤三中水处理系统功能菌群标准样品按以下步骤获得：a、水处理系统功能菌培养后分别固定于活性炭上；b、分别提取水处理系统功能菌基因组总DNA；c、用16s rDNA V3区通用引物进行PCR扩增；d、取每株功能菌PCR产物100μL混合，然后用核酸共沉剂将DNA沉淀析出，冷冻干燥后-20℃保存，使用前溶解于100μL TE缓冲溶液或无菌去离子水中，制成样品；e、样品与全部单一功能菌同步进行DGGE分析，样品条带与单一功能菌条带一一对应为水处理系统功能菌群标准样品；步骤二中16s rDNA V3区通用上游引物BSF338的碱基序列为：5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’，16s rDNA V3区通用下游引物BSR534的碱基序列为：5’-CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGTCCCGCCGCCCCCGCCCG-3’；步骤二中16s rDNA V3区通用引物PCR反应体系为50μL，其中上游引物的浓度为0.5μmol/L、下游引物的浓度为0.5μmol/L、dNTP的浓度为200μmol/L、模板为50ng、10×PCR Buffer缓冲液为12.5μL、Pfu DNA聚合酶为2.5U以及余量的无菌纯水；步骤二中16s rDNA V3区通用引物PCR反应条件：94℃预变性5min，然后20个循环的降落PCR，94℃变性30s、退火温度由65℃开始、每2个循环退火温度降低1℃、退火1min、20个循环后退火温度为55℃、72℃延伸1min，之后10个循环94℃变性1min、55℃退火min、72℃延伸1min，最后72℃延伸5min；步骤三中水处理系统功能菌群标准样品的制备步骤c中16s rDNA V3区通用上游引物BSF338的碱基序列为：5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’，16s rDNA V3区通用下游引物BSR534的碱基序列为：5’-CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGTCCCGCCGCCCCCGCCCG-3’；步骤三中水处理系统功能菌群标准样品的制备步骤c中16s rDNA V3区通用引物PCR反应体系为50μL，其中上游引物的浓度为0.5μmol/L、下游引物的浓度为0.5μmol/L、dNTP的浓度为200μmol/L、模板为50ng、10×PCR Buffer缓冲液为12.5μL、Pfu DNA聚合酶为2.5U以及余量的无菌纯水；步骤三中水处理系统功能菌群标准样品的制备步骤c中16s rDNA V3区通用引物PCR反应条件：94℃预变性5min，然后20个循环的降落PCR，94℃变性30s、退火温度由65℃开始、每2个循环退火温度降低1℃、退火1min、20个循环后退火温度为55℃、72℃延伸1min，之后10个循环94℃变性1min、55℃退火min、72℃延伸1min，最后72℃延伸5min。

2、根据权利要求1所述的一种功能菌群在水处理系统中稳定性的检测方法，其特征在于步骤三中水处理系统功能菌群标准样品的制备步骤a水处理系统功能菌培养后分别固定于活性炭上：分别挑选水处理系统功能菌单菌落转入5mL LB培养基中培养12～16h，然后离心，离心沉淀分别用1mL无菌水重悬，再将重悬液接种于无菌的活性炭体系中，固定48h；其中活性炭体系由100mL水和10g活性炭组成。

3、根据权利要求2所述的一种功能菌群在水处理系统中稳定性的检测方法，其特征在于步骤三中水处理系统功能菌群标准样品的制备步骤b将5g固定有功能菌群的活性炭置于三角瓶中加入5mL DNA抽提缓冲液进行超声振荡，然后加入100μL浓度为50mg/mL的蛋白酶K，在37℃、225r/min的条件下摇床30min，之后加入3mL质量浓度为10％的SDS裂解液，再置于65℃环境中水浴2h，而后将三角瓶中的物质移入50mL离心管在室温、12000r/min的条件下离心10min，向离心上清液中加入等体积的氯仿/异戊醇在12000r/min条件下离心30min，并用体积浓度为75％乙醇清洗离心沉淀，再将离心沉淀溶解于TE缓冲液，即可得到功能菌群基因组总DNA。