[发明专利]变异型萤火虫荧光素酶

说明书

技术领域

本发明涉及一种特征为对ATP的活性和对dATP的活性之比(dATP/ATP)比野生型低的变异型萤火虫荧光素酶(荧光素酶)及其基因、含有上述基因的重组载体、及上述变异型荧光素酶的活性评价方法。

背景技术

在测定DNA碱基序列的测序法中，基于Sanger法的测序法被广泛利用。在该方法中，使引物与DNA模板结合，以该引物的3’末端为起点通过DNA聚合酶掺入双脱氧核糖核苷酸(dNTP：dATP、dGTP、dCTP、dTTP)，与此同时进行新的DNA的合成反应。此时，在反应系统中预先少量加入4种不同的荧光物质标记的脱氧核糖核苷酸(ddNTP：ddATP，ddGTP，ddCTP，ddTTP)。当在反应过程中掺入ddNTP时，合成反应在此处停止，产生各种大小的DNA片段。对应于在该产物中掺入的ddNTP的种类，因为掺入了不同的荧光物质，通过使之变性为单链后进行电泳，进行片段大小分离，能够测定模板DNA的碱基序列。

分析人类全DNA碱基序列的基因组计划中便是基于Sanger法进行测序分析的。该计划中还使用新型的毛细管电泳的测序分析装置，据此可实现分析自动化、高速化，分析大量的DNA碱基序列成为可能。

近年来，以廉价而快速的进行大量DNA碱基序列的分析为目的，基于各种各样的原理的测序分析法的开发在广泛的开展中。例如454Lifesciences公司开发的在配置于流式细胞仪上的小珠子上进行测序反应，可同时分析多个碱基序列的系统的大规模并行高速测序技术，已经作为产品进行开始销售。

在上述大规模并行高速测序技术中使用的测序法的原理之一中有一种被称为焦磷酸测序法的利用生物发光的DNA碱基序列的分析方法。在该方法中，使DNA模板与引物结合后，依次加入4种dNTP进行通过DNA聚合酶进行的延长反应。此时加入与模板匹配的dNTP时发生延长反应，与此相伴产生焦磷酸(PPi)。此处产生的PPi通过ATP硫酸化酶等转变为ATP。进一步以ATP为底物引起荧光素酶的荧光反应。如发光即表示掺入了匹配的dNTP，形成了模板的碱基序列已知的组合。

另一方面，作为在该反应系统中使用的酶之一的荧光素酶，因其具有催化发光反应的特殊性质，除了测序分析，还被利用于基于ATP的定量的细菌数检测、细胞增殖检测、测定基因转录活性的机器人自动化检测、细胞内标记·酶的高敏感度检测等各种检测系统中。另外，该荧光反应的利用还可以应用于细胞、培养组织、固体水平，使该酶成为在荧光成像领域内不可欠缺的工业上重要的酶之一。

因此，以工业上更进一步的应用为目标，进行着各种变异型荧光素酶的开发。例如有通过氨基酸序列的替换增强荧光强度的荧光素酶的报道(专利文献1)，其记载有将第419到428位的氨基酸中至少1个替换为具有在该氨基酸的分子量以上的分子量的非极性氨基酸(丙氨酸、脯氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、色氨酸)时增加发光强度。

另外还有提高了热稳定性(专利文献2～5)、获得针对表面活性剂的耐性(专利文献6)、提高底物亲和性(专利文献7～9)、改变发光波长(专利文献10～11)、提高荧光的持续性(专利文献12)等变异型荧光素酶的报道。

专利文献1：特开2007-97577号

专利文献2：特许第3048466号

专利文献3：特开2000-197487号

专利文献4：特表平9-510610号

专利文献5：特表2003-518912号

专利文献6：特开平11-239493号

专利文献7：国际公开第99/02697号

专利文献8：特表平10-512750号

专利文献9：特表2001-518799号

专利文献10：特许第2666561号

专利文献11：特表2003-512071号

专利文献12：特开2000-197484号

发明内容

发明欲解决的课题

进行利用生物发光的测序分析时的问题为本来被利用为聚合酶的底物的dATP的使用受到限制。当dATP比较弱时，由于它作为荧光素酶的底物发挥作用，即使在聚合酶引发的延长反应时未发生掺入也可检测出荧光信号，妨碍了正确的测序信号的分析。