[发明专利]一种植物源抗灰霉蛋白及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物农药领域，尤其涉及一种植物源抗灰霉蛋白及其应用。

背景技术

化学农药的长期使用已经造成严重后果：农产品和土壤中的农药残留量越来越高，使农产品产量和质量严重下降，导致同过量摄入农药有关的疾病发病率的升高；有益生物的密度极度下降，自然群落遭到了严重的破坏；病原菌和害虫的抗药性普遍提高；化学农药的超量使用，导致农产品生产成本逐年提高，加重了农民的负担。随着人们环保意识的日益增强，化学农药将被逐步淘汰，取而代之的是生物农药，因其不污染环境、对人和动植物安全、选择性强、病原菌和害虫难以产生抗药性，而受到世界各国的高度重视，被誉为“绿色农药”，是今后农药发展的理想选择。目前，在我国农药施用中，生物农药所占的比例仅占1％左右，且效价低、品种少。真菌病害是威胁农作物生产的自然灾害之一，这种病害严重发生时，可造成农作物大幅度减产和农作物品质变劣，甚至引起人畜中毒，严重影响国民经济和人民生活。生产上80％以上的植物病害是由真菌侵染引起的，因此研究抗真菌植物病害的生物农药是成功防治植物病害的基础和关键。

灰霉病是蔬菜、果树和花卉上一种常见的重要病害。灰霉病的病原为半知菌亚门的灰葡萄孢(Botrytis cinema)，该病菌寄主范围广，是温室和露地栽培普遍发生的病害，也是产后贮藏和运输过程中的主要病害。近年来，保护地蔬菜灰霉病日趋严重，导致烂果烂叶，产品质量下降，损失严重。灰霉病也是葡萄、草莓、猕猴桃生产中危害最大的病害之一，主要危害果实，对产量和质量影响很大，是制约葡萄、草莓、猕猴桃生产发展的一大病害，更是产后贮藏过程中的毁灭性病害。灰霉病还是大棚花卉的重要病害，严重时可引起大量落花落叶，降低观赏价值。随着保护地种植面积的增加，灰霉病给生产带来的危害日益突出。灰霉病自上个世纪的八十年代开始逐渐加重，目前已经成为影响我国果蔬产业健康发展的主要病害之一。

发明内容

为了解决上述问题，本发明的发明人提出并完成了本发明。

因此，本发明的目的是提供一种植物源抗灰霉蛋白。

本发明的再一目的是提供包含上述蛋白的生物农药。

本发明的再一目的是提供上述抗灰霉蛋白的应用。

本发明的抗灰霉蛋白可以从桑寄生(桑寄生科)、葛根(豆科)中提取。

根据本发明的抗灰霉蛋白，通过以下方法制备：

1)抽提，将植物材料放入搅拌器里，加冷的PBS提取缓冲液，然后放入4℃；

2)低温离心，收集上清液；

3)沉淀蛋白，向步骤2)中获得的上清液中加入硫酸铵，离心得到沉淀物；

4)纯化得到抗灰霉蛋白。

根据本发明的蛋白，其中，步骤1)可以重复1～3次，合并各次得到的上清液，用于沉淀。

根据本发明的蛋白，其中沉淀蛋白的步骤3)可以具体包括以下步骤：

a)向步骤2)中获得的上清液中加入硫酸铵，达到20％硫酸铵饱和度，离心得到粗蛋白和上清液；

b)向步骤a)中获得的上清液中加入硫酸铵，达到40％硫酸铵饱和度，离心得到粗蛋白和上清液；

c)向步骤b)中获得的上清液中加入硫酸铵，达到60％硫酸铵饱和度，离心得到粗蛋白和上清液；以及

d)向步骤c)中获得的上清液中加入硫酸铵，达到80％硫酸铵饱和度，离心得到粗蛋白和上清液。

根据本发明的蛋白，其中，在步骤4)中，纯化方法为疏水层析、亲和层析和/或离子交换层析。

本发明还提供了包含上述抗灰霉蛋白的生物农药。

本发明还提供了上述抗灰霉蛋白的应用。

本发明的抗灰霉蛋白不仅能明显抑制灰霉孢子的萌发而且能明显抑制灰霉菌丝的生长。因此，本发明的蛋白可以有效地应用于植物灰霉病的防治，并可以作为一种安全、高效的生物农药。

附图说明

图1A～D显示了本发明的蛋白抑制灰霉萌发的结果，其中，A显示水作为对照，灰霉孢子正常萌发；B显示缓冲液作为对照，灰霉孢子正常萌发；C显示蛋白样品明显抑制灰霉孢子的萌发；在图1D中，左侧为对照缓冲液，右侧为蛋白样品对灰霉的抑制效果。

图2显示本发明的蛋白的离体叶片检测实验结果，其中，2号、9号蛋白和经20％、40％硫酸铵沉淀获得的样品抗灰霉活性明显，对照受到灰霉侵染。

具体实施方式

实施例1制备本发明的抗灰霉蛋白