[发明专利]花生C2H2型抗盐锌指蛋白基因AhZFP1及其编码蛋白质及其基因克隆方法

权利要求书

1、一种花生C2H2型抗盐锌指蛋白基因AhZFP1，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2、一种权利要求1所述花生C2H2型抗盐锌指蛋白基因AhZFP1编码的蛋白质，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

3、一种权利要求1所述花生C₂H₂型抗盐锌指蛋白基因AhZFP1的克隆方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)选用花生种子作为实验材料，经盐诱导后取植物组织置于研钵中，室温下抽提总RNA，并且采用DNase I处理，以去除样品中的基因组DNA污染。RNA含量及质量采用琼脂糖凝胶电泳检测。

(2)利用Promega的RT-PCR体系反转录获得cDNA。

(3)根据NCBI数据库中的EST信息设计花生AhZFP1基因编码区引物：

正向引物：5’-CAC TAC TCT GTT CGT ACT CTG-3’

反向引物：5’-TGC TCT TCA ACC TTC TTC-3’

反应体系：2.5μl含MgCl2的10×PCR缓冲液，0.5μl 10μM的引物，1.0μl 20mM的dNTPs，1μl cDNA样品，0.5μl Ex-Taq酶，19μl双蒸水。PCR反应程序为95℃预变性5min，95℃变性30s，55℃复性30s，72℃延伸1min，28个循环后，72℃延伸10min。

(4)PCR产物回收后与pMD18-T simple vector连接，连接产物转化E.coliTop 10感受态细胞，采用蓝白斑法筛选阳性克隆。筛选的阳性克隆经PCR进一步验证后测序，获得AhZFP1基因。