[发明专利]一种制备重组人血清白蛋白与干扰素α融合蛋白的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域。具体涉及一种制备重组人血清白蛋白与干扰素α融 合蛋白的方法。

背景技术

干扰素(IFN)是一组具有多种功能的活性蛋白质(主要是糖蛋白)，是一种由 单核细胞和淋巴细胞产生的细胞因子。它们在多种细胞上具有广谱的抗病毒、影响 细胞生长和分化、调节免疫功能等多种生物活性。根据干扰素蛋白质的氨基酸结构、 抗原性和细胞来源，可将其分为：IFNα(白细胞型)、IFNβ(成纤维细胞型)、IFN γ(免疫型)。IFNω属于IFNα家族，其结构和大小与其它IFNα稍有差异，但抗 原性有较大的不同。现在公认IFNβ和IFNγ只有一个亚型，而IFNα有约二十余 个亚型。自80年代以来，许多研究显示，干扰素(尤其是IFNα及IFNγ)除具有 抗病毒、免疫调节的作用外，还具有明显的抗细胞增殖作用。因此，目前干扰素已 被用于治疗多种人类疾病。

人重组干扰素在临床上都已被广泛地运用于抗病毒及抗肿瘤。多年来，干扰素 是一直被用于治疗丙型，乙型肝炎的首选用药。但干扰素的疗效并不太理想，只在 较小比例的患者在停止用药之后仍能维持对病毒的抑制作用。主要的问题在于干扰 素的血液半衰期只有仅仅3-6个小时，为达到治疗效果一般肝炎病人需要每周至少 接受三次注射，给病人带来巨大的痛苦。

针对上述干扰素在人体内半衰期短的缺点，美国的罗氏制药(Roche)和先灵 葆雅(Schering-Plough)将干扰素聚乙二醇化，以保障一个稳定的血浆浓度，聚乙 二醇化的干扰素展示出较好的临床治疗效果。目前，聚乙二醇化的干扰素在临床上 已经在很大程度上替代了普通干扰素单体。此外，采用重组人血清白蛋白与干扰素 的融合蛋白也可以克服干扰素在人体内半衰期较短的缺点，有研究表明，在克鲁维 氏酵母中表达的HSA-IFNα融合蛋白(Albuferon)在猕猴体内的半衰期比普通IFN α延长了大约18倍。

重组人血清白蛋白与干扰素α融合蛋白的制备涉及到酵母工程菌的发酵过程以 及后续的纯化过程。重组质粒和酵母染色体基因竞争利用共同的蛋白表达系统、代 谢能量以及生物合成的前体等，从而造成受体细胞生长缓慢和重组质粒的不稳定。 而那些丢失了重组质粒的细胞与受体细胞共享培养基和竞争生长，可以导致基因表 达的产率降低。故外源基因在宿主细胞中的表达受很多因素的影响，不仅要考虑到 工程菌本身的因素，还要顾及工程菌培养过程中外部条件，如发酵过程中每个营养 成分的含量，温度，pH，溶氧浓度等。并且后续的纯化过程也非常重要，直接影响 最终重组融合蛋白的纯度与生物活性。

因此，本领域迫切需要提供一种高效制备重组人血清白蛋白与干扰素α融合蛋 白的方法，并将其运用到重组融合蛋白药品的生产中。

发明内容

本发明的目的是提供一种高效制备重组人血清白蛋白与干扰素α(较佳干扰素 α-2b)融合蛋白的方法。

为了实现上述目的，本发明首先提供了一种制备重组人血清白蛋白与干扰素α 融合蛋白的方法，包括如下步骤：

a)构建含有重组人血清白蛋白与干扰素α融合蛋白基因的表达质粒；

b)将步骤a)得到的含有重组人血清白蛋白与干扰素α融合蛋白基因的表达质 粒转化到酵母工程菌中，建立表达重组人血清白蛋白与干扰素α融合蛋白的酵母工 程菌种子库；

c)将步骤b)得到的酵母工程菌种子库中的酵母种子菌以5％～30％(v/v)(较 佳10％～20％(v/v)，最佳10％(v/v))的接种量接种于酵母培养基中，溶氧不小于 10％的饱和度，25℃～37℃(较佳28℃～32℃，最佳30℃)培养60～90小时(较佳 60～72小时，最佳60小时)；

d)收集上清发酵液，分离纯化出所述重组人血清白蛋白与干扰素α融合蛋白。

在一个优选的实施方案中，所述重组人血清白蛋白与干扰素α融合蛋白中的干 扰素α选自干扰素α-2a、干扰素α-1b、或干扰素α-2b。

在另一个优选的实施方案中，所述酵母工程菌是酿酒酵母；更优选所述酵母工 程菌是酿酒酵母BJ5457。