[发明专利]蛋白HtpX-P3及应用其提高酶热稳定性的方法

说明书

技术领域

本发明属于提高酶的热稳定性的技术领域，具体涉及一种融合蛋白HtpX-P3，及利用该蛋白增强酶热稳定性的方法。该融合蛋白序列包含来源于嗜热古菌硫矿硫化叶菌(Sulfolobus solfataricus)中的一种热激蛋白基因htpX-3所表达的蛋白序列。

背景技术

随着工业生物技术和酶工程的不断发展，酶的应用越来越普遍，酶作为生物催化剂具有催化效率高、催化专一性强、作用条件温和等显著特点，但是在酶作为蛋白，普遍存在热稳定性差的特点。这使得一些工业生产不得不在反应器中增加冷却系统，增加了工业成本和各种代谢物对产物的污染。另外，酶的低热稳定性使得商业酶在分离纯化和包装运输过程中都容易失活。因此，酶的热稳定性是酶生产和工业催化中需要解决的一个关键问题。

目前，已经有很多方法应用于提高酶的热稳定性。包括酶分子的化学修饰、理性设计以及定向进化等。应用最广泛的酶化学修饰技术是利用大分子或小分子修饰剂对酶分子的侧链进行改造，以获得具有工业应用价值的蛋白。利用化学修饰技术已经成功地使一些酶的热稳定性得到显著的提高，所用到的修饰剂包括大分子物质如糖类等以及一些小的化学分子(Davis BG，2003，Chemical modification of biocatalysts.Curr OpinBiotechnol，14：379)。酶分子的理性设计是指在已知酶的结构与功能关系的基础上，有目的地改变酶的某一活性基团或氨基酸残基，从而使酶产生新的性状。利用理性设计提高酶的热稳定性，主要以目标酶蛋白的氨基酸序列与一些高温酶蛋白序列的同源性作为氨基酸取代的标准，由于多数情况下对酶的结构、功能和作用机制没有完全了解，所以，并非所有的理性设计都能取得预期的结果(Uwe T Bornscheuer等，2001，Improved biocatalystsby directed evolution and rational protein design.Current Opinion in ChemicalBiology，5：137-143)。酶的体外定向进化(简称定向进化)是近些年兴起的改造酶分子的新策略，它是由两个相互独立的关键技术组成。一个是随机基因文库的构建，另一个是特定酶(特别是增加催化活性、增强选择性或稳定性)的筛选策略。目前，已经通过定向进化技术得到了一些热稳定性得到显著提高的酶(G.J.Williamsa等，2004，Directed evolutionof enzymes for biocatalysis and the life sciences.Cellular and Molecular LifeSciences，61：3034-3046)。

提高酶热稳定性的方法还包括固定化和添加保护剂。固定化以后的酶，其中一些作用温度可以达到80℃以上(Cesar Mateo等，2007，Improvement of enzyme activity，stability and selectivity via immobilization techniques.Enzyme and MicrobialTechnology，40：1451-1463)。由于方法简单、成本低下和易于操作等多方面原因，添加保护剂是目前工业上提高酶稳定性的最重要手段(Manning M C等，1995，Approaches forincreasing the solution stability of proteins.Biotechnology and Bioengineering，48(5)：506-512)，大部分商业酶成品中都添加有一定的保护剂以延缓酶的失活。保护剂的成分包括一些单糖、多糖类物质以及一些有机小分子物质等。

热激蛋白(heat shock proteins，简称Hsps)广泛存在于包括真核生物、细菌和古菌在内的各种生物体内，根据分子量的不同分为不同的类别，其中分子量为35kDa以下的一类称为小分子量热激蛋白(small heat shock proteins，sHsps)。这类蛋白是最常见的分子伴侣，广泛存在于所有生物体内。