[发明专利]一种高效的ELP融合蛋白酶及其制备和应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种重组的融合蛋白酶，以及该蛋白酶在切割融合蛋白中的应用。

背景技术

随着大规模测序技术发展和广泛应用，人类基因组计划及其他物种包括海胆、斑马鱼、文昌鱼等基因组计划也相继完成。对这些物种的基因组测序的直接结果是产生成千上万个基因，对这些基因功能的阐明，有助于我们了解物种在进化过程的位置；对导致疾病的基因的研究有助于了解发病机理，寻找治疗的靶点，开发治疗相应治疗药物；同时，大量的药物蛋白基因也有待我们去研究其生理活性，及作用靶点，为开发新型的治疗药物提供基础。基因功能研究的方法很多，包括基因敲除技术，蛋白组学的研究，RNA干扰等。其中一个最直接的研究方法是把所研究的基因进行重组表达，获得相应的蛋白后进行生理和生化活性的研究和对其进行结构生物学的分析从而阐明其功能。由于物种基因的差异性，并不是所有的基因都能成功地表达。基因不表达，蛋白表达量低或表达的蛋白不稳定形成不可溶的包涵体，这些现象在异源表达系统中经常出现，特别在原核表达系统中表达真核生物基因。随着DNA重组技术的发展，可以将目的基因与表达亲和标签的基因进行融合，然后克隆在表达载体中进行融合表达，这些亲和标签不但可以帮助所融合的目的蛋白折叠，提高目的蛋白的可溶性和表达量，同时亲和标签能与相应的亲和层析的树脂结合，起到一步纯化融合蛋白的作用。常用的亲和纯化标签包括谷胱甘肽-S-转移酶(Glutathione-S-Transferase，GST)，麦芽糖结合蛋白(Maltose-binding Protein，MBP)，His标签等。最后利用蛋白酶对含有相应蛋白酶酶切位点的融合蛋白进行切割，使目的蛋白与亲和标签蛋白分离开，通过进一步的层析分离除去亲和标签和蛋白酶而获得目的蛋白。

亲和层析是一种非常有效的分离方法，在不需要了解所融合蛋白的物化性质的情况，就可以实现一步纯化融合蛋白，这种纯化技术被广泛应用。但是，应用亲和层析分离技术需要昂贵的亲和树脂，和相应的纯化设备，这样限制了同时表达多种蛋白用于高通量的结构生物学研究和高通量的药物蛋白筛选。1999年，报道了一个热敏感的纯化标签弹性蛋白样多肽(Elastin Like Polypeptides，ELP)，这个标签起源于弹性蛋白的重复的五肽“Val-Pro-Gly-Val-Gly”。ELP可以经历一个可逆相变过程，称为反温度相变(Inverse TemperatureTransition)。当温度低于相变温度(Transition temperature，Tt)时，ELP在液相表现出高度可溶，然而当温度高于Tt时，亲水的ELP则会脱水而发生凝集，而且ELP融合蛋白也具有这种特性，但是需要指出的是发生相变的时候只是ELP发生凝结而所融合的外源蛋白并没有发生变性或沉淀。利用ELP的这种特性，可以方便和快速地利用ELP标签来纯化ELP融合蛋白，而且纯化过程中不需要层析分离而避免了昂贵的亲和树脂和纯化设备，同时ELP融合蛋白的浓缩和更换缓冲液也变得非常简单。通过加热或提高盐离子浓度触发ELP融合蛋白的凝集，通过离心使ELP融合蛋白于表达宿主蛋白中分离出来，用低盐低温的溶液使沉淀的ELP融合蛋白重新溶解，再进行离心除去不可溶的蛋白而获得ELP融合蛋白，通过重复触发沉淀、离心和重溶步骤可以获得更纯的ELP融合蛋白，这种纯化过程称之为逆相循环(Inverse TransitionCycling，ITC)。