[发明专利]抗桔青霉素鸡卵黄抗体的制备方法

权利要求书

1.一种抗桔青霉素鸡卵黄抗体的制备方法，其特征在于该方法包括以下 步骤：

(1)合成桔青霉素免疫抗原和包被抗原；

(2)将桔青霉素免疫抗原乳化后注入鸡体内进行免疫，免疫4次后持续收集鸡 蛋1～2个月；

(3)提取抗桔青霉素鸡卵黄抗体；

所述的步骤(1)中采用羰基二咪唑法，以牛血清白蛋白为载体合成桔青霉素 免疫抗原，采用碳二亚胺法合成桔青霉素包被抗原；采用羰基二咪唑法合成桔 青霉素免疫抗原的合成方法为：桔青霉素0.5mg溶于100～200μL甲醇中，加入 1mg的羰基二咪唑，混合均匀后，室温反应15～60min，自然挥干，用200μL的 二甲基亚砜溶解后，滴入2mL 5mg/mL牛血清白蛋白的0.1mol/L碳酸钠溶液， 37℃反应4～8h，反应结束后，反应混合物用0.01mol/L碳酸钠溶液及蒸馏水4℃ 透析3天，期间换液多次，真空冷冻干燥，于-20℃保存；取1mg桔青霉素人工 抗原粉末溶于1mL 0.1mol/L pH7.4的磷酸盐缓冲溶液中，并与福氏佐剂按体积 比为1∶1充分乳化制得免疫抗原；采用碳二亚胺法合成桔青霉素包被抗原的合 成方法为：桔青霉素0.5mg溶于500μL二甲基甲酰胺中，先后加入1mg碳二亚 胺盐酸盐及1mg N-羟基丁二酰亚胺，混合均匀后，磁力搅拌下避光室温反应 4～6h，然后往混合液中逐滴滴入2mL 5mg/mL卵清白蛋白的pH7.40.1mol/L磷 酸盐缓冲液，磁力搅拌下避光室温反应4～6h，反应结束后，反应混合物用 0.01mol/L pH7.4的磷酸盐缓冲液及蒸馏水4℃透析3天，期间换液多次，真空 冷冻干燥，于-20℃保存。

2.根据权利要求1所述的抗桔青霉素鸡卵黄抗体的制备方法，其特征在于： 所述的步骤(2)中桔青霉素免疫抗原免疫鸡的方式为：取22周龄的莱杭母鸡 4只，将乳化好的桔青霉素免疫抗原经鸡的皮下、双翼、大腿、胸肌多位点注 射；首次免疫采用福氏完全佐剂，以后免疫均采用福氏不完全佐剂；两周后免 疫第2次，以后每隔1～2周免疫一次，每次免疫的剂量为0.5mL/只；并于第4 次免疫后的第2周收集鸡蛋，持续收集1～2个月；收集的鸡蛋编号后于4℃保 存，并留取免疫前的鸡蛋作为阴性对照。

3.根据权利要求1所述的抗桔青霉素鸡卵黄抗体的制备方法，其特征在于： 所述步骤(3)中抗桔青霉素鸡卵黄抗体的提取方法，采用聚二乙醇二步法提纯 卵黄抗体，先从收集的免疫蛋中分离出卵黄，搅拌均匀；测量所得的蛋黄的体 积，按此体积的2～4倍加入4％PEG6000，混合均匀，按蛋黄体积的0.2～0.5倍 加入氯仿，搅拌均匀，静置2～4h；将稀释液于低温高速离心机以8000～12000rpm 离心10min；将分离所得的上清液纱布过滤，测量上清液的体积，按上清液体 积的0.2～0.5倍在磁力搅拌下逐滴滴加40％PEG6000，静置2～4h，将稀释液于 低温高速离心机以8000～12000rpm离心10min，倾去上清液，沉淀部分即为抗 桔青霉素鸡卵黄抗体IgY粗提物，抗桔青霉素鸡卵黄抗体IgY粗提物用蒸馏水 洗脱纯化，洗脱后产品用真空冷冻干燥机进行冷冻干燥，即制得纯抗桔青霉素 鸡卵黄抗体IgY干粉成品，将所制得的抗桔青霉素鸡卵黄抗体IgY干粉分装后 保存于-20℃。