[发明专利]一种转基因毕赤酵母工程菌株及其构建方法

说明书

技术领域：

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种转基因毕赤酵母工程菌株及其构建方法。

背景技术：

三苯基甲烷类染料是仅次于偶氮染料的一大类染料，应用广泛，由于其具有生物毒性及致癌、致畸、致突变的“三致”作用已严重威胁到人类健康及生态平衡。其中的孔雀石绿更是由于曾被广泛用作水产养殖的防霉剂导致在水体及鱼体中残留而引起世人的广泛关注。

近年对印染废水的物理、化学及生物处理方法进行了多方面的研究，已取得一定的进展。物理、化学方法主要包括以无机和有机高分子絮凝剂为主的絮凝法，以臭氧、H₂O₂和Fenton试剂、Cl₂O为主的氧化法，利用氧化还原、电凝聚及电气浮等作用的电化学法，利用光催化氧化法的光化学法，利用吸附剂的吸附法和利用超滤或反渗透技术的膜分离法等。这些方法均有成本高和造成二次污染等缺点。

嗜水气单胞菌Aeromonas hydrophila subsp.DN322是从印染废水处理厂的活性污泥中分离到的一株对结晶紫、碱性品红、灿烂绿及孔雀绿等多种三苯基甲烷类染料具有高效脱色能力的嗜水气单胞菌。从该菌中分离到一种新的三苯基甲烷类染料脱色酶TpmD基因，三苯基甲烷类染料脱色酶TpmD蛋白分子量为58.8kDa，等电点为5.6。酶蛋白是由两个相同分子量的亚基组成的二聚体，每个亚基的分子量为29.4kDa。该酶能够催化结晶紫、碱性品红、灿烂绿及孔雀石绿等多种三苯基甲烷类染料脱色降解，对底物具有结构专一性。脱色酶TpmD催化的脱色反应依赖于分子氧和辅酶NADH或NADPH的存在，属于NADH/NADPH依赖型的氧化酶类。酶的分子结构中含有血红素卟啉环，催化活性受细胞色素P450特异性抑制剂的强烈抑制，催化反应中有自由基的参与，这三方面特性与P450单加氧酶十分相似，但光谱特征上却没有典型P450单加氧酶在450nm处所特有的特征吸收峰(“细菌脱色酶TpmD对三苯基甲烷类染料脱色的酶学特性研究”，任随周，郭俊，王亚丽，岑英华，孙国萍微生物学报，第46卷第3期，第385～389页，2006年4月)。

发明内容：

为了充分发挥嗜水气单胞菌DN322三苯基甲烷类染料脱色酶TpmD在三苯基甲烷染料染料治理中的作用，实现该酶的大规模产业化应用，首先要实现该酶的大量、稳定表达，并可分泌到胞外。但是嗜水气单胞菌对鱼类、蛙类具有潜在的致病性从而限制了该菌株在环境生物修复中的广泛应用。而毕赤酵母表达系统是近年来发展起来的一种高效的真核表达系统，它具有表达量高、稳定性好、酶活性高、能分泌至胞外、便于工业化生产等优点，因而可用于酶制剂的产业化发酵生产。

基于上述发明构思，本发明的目的是提供了一种能胞外分泌三苯基甲烷类染料脱色酶，裂解三苯基甲烷类染料骨架结构，进行氧化脱色的转基因毕赤酵母工程菌株及其构建方法。

本发明通过下述方案予以实现的：

本发明所述的转基因毕赤酵母基因工程菌株，是将嗜水气单胞菌DN322中的三苯基甲烷类染料脱色酶TpmD基因，其DNA序列如SEQ1所示，编码的蛋白序列三苯基甲烷类染料脱色酶TpmD如SEQ2所示，与表达载体连接后导入毕赤酵母Pichia pastoris X-33，构建而成的转基因工程菌，该菌能胞外分泌三苯基甲烷类染料脱色酶。

所述转基因毕赤酵母基因工程菌株的构建方法，其步骤如下：

a)从嗜水气单胞菌DN322克隆三苯基甲烷类染料脱色酶TpmD基因；

b)将三苯基甲烷类染料脱色酶TpmD基因与表达载体pPICZaA载体连接，构建质粒pPICZaA-tpmD；

c)将构建的质粒pPICZaA-tpmD酶切线性化后，导入毕赤酵母菌Pichia pastoris X-33中；

d)测定三苯基甲烷类染料脱色酶TpmD基因转化进入了毕赤酵母菌Pichia pastoris X-33中，从而得到转基因毕赤酵母基因工程菌株。

本发明所构建的工程菌的活性测定是通过将工程菌经甲醇诱导表达后，通过对三苯基甲烷类染料的脱色来测定的。