[发明专利]利用人类皮肤黑色素细胞分析美白剂毒性和功效的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种利用原代培养的人类皮肤黑色素细胞对美白剂进行毒性分析和功效分析的方法，可以替代活体动物(或人体)皮肤及瘤性黑色素细胞，应用于美白化学原料或含美白剂的化妆品配方的毒理学和功效学实验领域。

背景技术

皮肤是人体最大的器官，是外源化学因素(化学品、药品、化妆品等)或物理机械因素(紫外线、微波等)毒性作用的主要器官。利用动物或人体皮肤进行皮肤毒性测试和功效测试是化妆品、药品、食品添加剂及原料、农药、生物制品、化学品健康安全评价的常规检测项目。传统的皮肤安全性评价实验不仅要求一定数量和高质量的实验动物，而且试验周期长，成本高，某些反应会给动物造成极大的痛苦。世界各国非常重视实验动物的福利问题，如上世纪欧洲各国、美国颁布的动物福利法，中国的《实验动物管理条例》等。随着国际动物保护和动物福利运动的兴起，40多年前国外最先提出了以″减少(reduce)″、″替代(replace)″和″优化(refine)″为核心内容的“3R原则”，并在此基础上大力开展动物实验替代方法的研究。特别是近20年，不再以动物模式为基础的毒理学系统已被科学家采用，并被许多国家的政府、欧洲和国际法规所接受。2002年11月7日欧洲议会与欧盟理事会在布鲁塞尔达成协议，决定“从2009年3月11日起在欧盟范围内禁止使用动物进行化妆品毒性和过敏实验”，也“不允许成员国从外国进口和销售进行动物实验的化妆品”。欧盟新化学品法规REACH(化学品的注册、评估、许可和限制)也提出鼓励动物试验替代方法的开发和应用。采用体外培养的细胞或构建的组织工程器官进行毒性评价和功能性评价是动物试验替代技术的关键领域之一。

表皮和真皮交界处的黑色素细胞是皮肤中的黑色素颗粒的产生部位，在外界各种刺激 (如UV，化学物，超氧化物等)和体内一些激素、代谢产物(如促黑色素分泌激素，碱性成纤维细胞生长因子，内皮素等)作用下，黑色素颗粒分泌增加，经过与表皮基底部的角质形成细胞的突触连接，将生成的黑色素颗粒传递到角质形成细胞中发挥其生物学效应。大约一个黑色素细胞和其周围的40个角质形成细胞形成一个这样的功能单位，称之为表皮黑色单位。正常的黑色颗粒的形成对于皮肤抗紫外，抗氧化具有着积极的作用。但是在一些病理情况(如过敏性皮炎，日光性皮炎，炎症，黑斑病等)下出现的黑色素过度表达，则对患者的精神和身体都产生很大的影响。所以对抗这种黑色素过度表达的美白剂常用于化妆品、药品中。另一方面，各种功能性的化妆品日益成为人们日常生活中的必需生活品，在满足消费者改善肤质愿望的过程中，也给消费者带来了精神上的愉悦。越来越多的来源于合成化工产品、天然动植物提取物、生物活性因子等被开发利用为美白物质，同时，也应注意到各种具有美白功效的化学物质的广泛使用可能给消费者带来一定程度的潜在健康风险，而建立一种既安全、高效又人道(既替代动物实验)的毒性和功效的评估方法则是我们此发明中所解决的问题。

目前的美白物质毒性与功效评价主要采用活体动物试验或体内人体志愿者试用试验，体外方法主要利用人源或啮齿类(大鼠、小鼠)动物的黑色素瘤细胞试用试验。但现有的体外方法有其不足之处：通常黑色素表达不够稳定，而且肿瘤的或动物的细胞与正常的人体细胞形态和基因都存在一定差异。

开发含黑色素细胞的组织工程化皮肤是进行美白毒性和功效评价的另一途径，如2003年，Yoon T.J.等将分离培养的原代黑色素细胞加到组织工程化皮肤中，构建含黑色素细胞的人工皮肤(Yoon T.J.，Lei T.C.，Yamaguchi Y.，Batzer J.，Wolber R.，Hearing V.J.，Anal.Biochem.，318，260-269(2003))，但这种含黑色素细胞的工程化皮肤还不成熟，而且造价昂贵且培养不易。

发明内容

本发明所要解决的第一个技术问题，就是提供一种成熟的利用人类黑色素细胞对美白剂进行毒性和功效分析的实验方法，因为细胞来源于人类，故实验结果能真实地反映人类皮肤组织中的黑色素细胞对受测试物质的反应效果，因而能满足化妆品领域对美白剂毒性和功效实验的研究。

在上述基础上，本发明还涉及实验中所用的人类黑色素细胞的培养技术，该培养技术成熟，培养容易周期短，重复性好，而且价格低廉。

本发明原代人类黑色素细胞的培养技术主要分以下几个步骤：

I、人类皮肤原代黑色素细胞的培养

(1)人类皮肤黑色素细胞培养液的配置

1)配制人类黑色素细胞培养液：