[发明专利]结核Hsp65抗原基因的玉米表达载体及其应用无效
申请号: | 200810220697.8 | 申请日: | 2008-12-31 |
公开(公告)号: | CN101613714A | 公开(公告)日: | 2009-12-30 |
发明(设计)人: | 李君武;胡建广 | 申请(专利权)人: | 暨南大学 |
主分类号: | C12N15/82 | 分类号: | C12N15/82;C12N15/31;A61K39/04;A61P31/06 |
代理公司: | 广州市华学知识产权代理有限公司 | 代理人: | 裘 晖;陈燕娴 |
地址: | 510632广*** | 国省代码: | 广东;44 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 结核 hsp65 抗原 基因 玉米 表达 载体 及其 应用 | ||
技术领域
本发明涉及一种包含了结核Hsp65抗原基因的玉米表达载体及其应用,属于生物医学工程领域。
背景技术
结核病是一种严重危害人类健康的传染性疾病,由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)感染引起。全球大约有三分之一的人感染过结核(大约21亿),每年新发病1000万人,卡介苗(BCG)作为预防结核病的疫苗,近100年来虽然广泛用于新生儿的预防接种,但保护率只有50%左右,而对成年人的保护率在不同地区,在0~80%之间波动;另外接种BCG还能使少数人发生较严重的并发症,发生播散性感染而致死。鉴于结核病发生的严重态势,加强结核病的防治工作、探索结核病的早期诊断及研制开发新型预防、治疗的疫苗,已成为当前国际乃至我国关注的紧迫而优先的课题。
新型抗结核疫苗的研制,选取优势抗原最为重要。结核分枝杆菌的Hsp65蛋白(热休克蛋白65KD)属于Hsp70家族,有很强的免疫原性,能诱导和增强机体的体液免疫和细胞免疫的发生,并可激活γδT细胞,可以在动物体内对结核分枝杆菌的感染产生强烈的保护性免疫反应,是人体感染结核杆菌以后免疫系统的主要靶抗原和T细胞攻击的主要对象。因此Hsp65是一种理想的疫苗候选抗原。
转基因植物生物反应器是利用基因工程重组技术和植物自生代谢原理产生具有特殊功能的蛋白,常见的有人或动物的保护性抗原蛋白、抗体和一些重要的多肽等,它们具有重要药用价值和商业市场。转基因植物生物反应器和微生物反应器、动物反应器相比较具有生产成本低、表达产物具有天然的生物活性、安全性好的优点,这也是转基因植物得到迅速发展的重要原因之一。
启动子是调控外源基因在植物体内表达的开关,它直接影响到外源基因在植物体内的丰度、表达组织或发育时期,所以,能否选择到适宜受体植物的启动子使其有较高的表达量,成为转基因植物发展的一个瓶颈问题。
植物表达启动子分为三种:组成型启动子、诱导型启动子和组织特异型启动子。目前在绝大多数双子叶转基因植物中广泛使用的启动子是来源于花椰菜花叶病毒的CaMV35S启动子,单子叶转基因植物主要使用来自玉米的Ubiquitin启动子和来自水稻的Actinl启动子等。CaMV35S、Actinl、Ubiquitin等均为强组成型启动子,控制外源的基因在转基因植株的各个部位和整个生育期表达。CaMV35S启动子在双子叶植物中的表达效率高于单子叶植物,而Actinl、Ubiquitin等启动子在单子叶植物中的表达效率较高,这可能与单、双子叶植物,在转录因子和启动子序列识别上有差异。
选择合适的植物表达启动子,是解决表达量低的有效途径,而选择的依据主要以受体材料的特性来决定。在植物基因工程研究中,一个表达载体系统是至关重要的。目前报道植物转基因研究中多采用高效组成型启动子,如CaMV35S、MMV启动子等,在它们调控下,外源基因在转基因植物中所有的发育阶段和所有的部位都能表达,这在转抗病基因和抗虫基因时,会收到较好的效果。但对表达特殊营养成分的基因,例如表达乙肝抗原基因等,外源基因在植物内持续高效的表达,不仅造成营养成分的浪费,而且往往会造成植物形态的改变,严重时还会影响到植物的正常发育。
发明内容
本发明的目在于克服现有技术的缺点,提供一种包含结核Hsp65抗原基因的玉米表达载体的构建方法。
本发明的另一目的在于提供上述方法构建的玉米表达载体的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现:一种包含了结核Hsp65抗原基因的玉米表达载体的构建方法,包括以下步骤:
(1)根据人结核分支杆菌H37Rv株Hsp65基因的编码序列设计抗原基因Hsp65的1对引物:
上游引物序列为:P15′-TT AGATCT GCAATGGCCAAGACAATTGCGT-3′,含BglII酶切位点和起始密码子ATG;
下游引物序列为:P25′-CC TCTAGA TCAGAAATCCATGCCACCCATG-3′,含Xba I酶切位点和终止密码子CTA;
(2)以质粒pEGFPHsp65-Esat6为模板,用步骤(1)设计的引物P1和P2进行常规链式聚合酶反应扩增Hsp65;将扩增产物Hsp65直接插入pMD20-T载体,获得目的基因pMD20-THSP65;
(3)pCR-G载体的构建:
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