[发明专利]头孢氨苄残留酶联免疫检测试剂盒及其应用

权利要求书

1.一种头孢氨苄残留酶联免疫检测试剂盒的制备方法，其特征在于：

(1)蛋白偶联抗原的合成：

A.头孢氨苄免疫抗原的合成：将头孢氨苄和牛血清白蛋白采用碳二亚胺法进行偶联得到 免疫抗原；具体操作如下：取头孢氨苄15mg溶于5mL 0.01mol/L，pH 7.4的PBS中，加入 25mg碳二亚胺和10mgN-羟基琥珀酰亚胺搅拌30分钟，取牛血清白蛋白10mg溶于活化的 头孢氨苄溶液中，25℃搅拌反应2小时，再4℃反应过夜；4℃条件下，用PBS透析3天，得 到头孢氨苄免疫抗原，分装冻存；

B.头孢氨苄包被抗原的合成：将头孢氨苄和卵清蛋白采用戊二醛法进行偶联得到包被抗 原；具体操作如下：取头孢氨苄10mg溶于5mL 0.01mol/L，pH 7.4的PBS中，加入1％戊二 醛溶液搅拌30分钟，取卵清蛋白30mg溶于1mL PBS，加入到活化的头孢氨苄溶液中，25℃ 搅拌反应2小时，4℃反应过夜；4℃条件下，用PBS透析3天，得到头孢氨苄包被抗原，分 装冻存；

(2)单克隆抗体的制备：

A.动物免疫：将合成的免疫原与等量的弗氏完全佐剂乳化，腹腔注射8周龄雌性BALB/C 小鼠，剂量为100μg/只；然后以100μg/只的剂量加弗氏不完全佐剂腹腔注射加强免疫3次， 间隔2周；

B.细胞融合和克隆化：取免疫小鼠的脾细胞，按5∶1比例与Sp2/0骨髓瘤细胞融合，制 备杂交瘤细胞；采用有限稀释法筛选能够稳定分泌头孢氨苄单克隆抗体的杂交瘤细胞株，扩 大培养后液氮冻存；

C.单克隆抗体的制备与纯化：使用雌性BALB/C纯系小鼠，腹腔注射弗氏不完全佐剂0.5 mL/只，5天后腹腔注射杂交瘤细胞10⁶个/只，7天后取小鼠腹水，经辛酸-饱和硫酸铵法进行纯 化，分装，-20℃保存；

(3)试剂盒的制备：

A.酶标板的制备：

用包被缓冲液将头孢氨苄包被抗原稀释成0.5-1μg/mL，每孔加入100μL，37℃温育2h再 4℃过夜，倾去包被液，用稀释20倍的浓缩洗涤液洗涤4次，每次30秒，拍干，然后在每孔 中加入200μL封闭液，37℃温育2h，倾去孔内液体，干燥后用铝膜真空密封保存；

B.所用试剂的配置：

1)头孢氨苄系列浓度标准溶液，其浓度分别为0μg/L，0.05μg/L，0.1μg/L，0.5μg/L，1μg/L， 5μg/L；

2)蛋白浓度为0.1-1mg/L的辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG；

3)蛋白浓度为0.1-1mg/L的头孢氨苄单克隆抗体；

4)底物显色液由A液和B液组成，A液为用0.1mol/L pH5.0的柠檬酸缓冲液配制成0.1-1 mg/mL的过氧化脲溶液，B液为四甲基联苯胺先用无水乙醇配制2mg/mL的溶液，再用0.1 mol/L pH5.0的柠檬酸缓冲液配制成0.1-1mg/mL溶液；

5)终止液为1-2mol/L硫酸；

6)浓缩洗涤液为pH7.4含0.8-1.2％吐温20的0.01mol/L磷酸盐缓冲液；

7)样品稀释液为0.1％-1％牛血清白蛋白的0.01mol/L磷酸盐缓冲液。