[发明专利]Math1基因对感音神经性耳聋的治疗作用

说明书

技术领域

本发明属于感音神经性耳聋的基因治疗领域，具体而言涉及内耳特异性表达基因Math1重组腺病毒载体的构建、蜗内转染及其在感音神经性耳聋基因治疗中的应用。

背景技术

耳蜗毛细胞是终末分化细胞，作为机械感受细胞，它可以将声音刺激转换成电信号，在维持听觉方面有至关重要的作用。老化、耳毒性药物、感染、遗传、过度声刺激及自身免疫性疾病等多种原因均可引起耳蜗毛细胞的不可逆性损伤，进而导致永久性的感音神经性耳聋。感音神经性耳聋影响了全球数千万人，随着人类老龄化和工业化进程的加速，这一问题逐渐突显，并成为公共健康领域的重要议题。

尽管已经知道有超过60个基因的突变可以影响毛细胞或支持细胞从而引起耳聋和平衡障碍，但目前对这些基因的功能及其致聋的分子机制知之甚少，对感音神经性耳聋的基因治疗尚在探索中。

在鸟类和低等脊椎动物中，毛细胞损伤后可以发生自发替代反应，但在成年哺乳动物耳蜗，毛细胞丧失再生能力，耳蜗毛细胞的缺失是引起哺乳动物，包括人类耳聋的主要原因。

目前，治疗耳聋的可行性策略包括毛细胞凋亡的预防、耳聋的基因治疗及干细胞治疗。虽然已经找到分离内耳干细胞的方法，但因其分离困难，限制了干细胞在耳聋治疗中的应用，到目前为止，基因治疗仍然是治疗耳聋最有前途的办法。

耳聋基因治疗方法包括野生型基因(Wild-type gene)的导入和负调节基因的抑制两类方法以促进毛细胞再生进而恢复耳蜗功能。目前基因治疗研究使用的基因导入载体(Gene Delivery Vectors)多采用人类巨细胞病毒(CMV)、腺病毒(Adenovirus，AD)、腺相关病毒(Adeno-associated Virus，AAV)等病毒的启动子。

近年来，在哺乳动物内耳毛细胞发育、分化和再生及其机制方面的研究取得了突破性进展，为耳聋基因治疗的开展奠定了基础。Atoh1基因属于“碱性螺旋-环-螺旋型”(basic helix-loop-helix，bHLH)转录因子，在毛细胞分化过程中起到正调控作用，哺乳动物发育成熟后，Atoh1基因的表达被下调(Down-regulated)；研究表明在发育或成熟的耳蜗离体培养中过表达(Over-expression)Atoh1或其类似物可以引起异位毛细胞产生，Math1基因是Atoh1基因的鼠同源基因，其导入成熟的、卡那霉素致聋后豚鼠内耳的非感觉上皮细胞后可以诱导毛细胞的再生，并且实现了听功能的恢复。

根据基础研究的成果，Math1基因具有诱导耳蜗毛细胞前体分化的作用，因此构建一种携带Math1基因的病毒载体，实现Math1基因在哺乳动物耳蜗中高效表达，对于最终通过基因疗法治疗神经性耳聋有着十分重要的意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种表达Math1蛋白的重组腺病毒，其可以克服现有给药途径的一种或多种缺陷，安全有效地用于耳聋治疗。

本发明的另一个目的在于提供一种表达Math1蛋白的重组腺病毒的构建方法。

本发明的再一个目的是提供一种表达Math1蛋白的重组腺病毒在耳聋治疗方面的应用。

根据本发明，所述目的通过下述技术方案实现：一种表达Math1蛋白的重组腺病毒的构建方法，其包括下述步骤：

1、穿梭载体pshuttle2-Math1-EGFP的构建：

含有Math1-EGFP基因的质粒pRK5-Math1-EGFP(Genentech，Inc.，USA)经Xba I和Kpn I双酶切，电泳回收目的基因Math1-EGFP。穿梭载体pshuttle2经Xba I和Kpn I双酶切后，与Math1-EGFP片段一起用T4连接酶连接过夜，并转化大肠杆菌，提取质粒DNA，构建成含有目的基因的腺病毒穿梭表达载体pshuttle2-Math1-EGFP。

2、含有Math1-EGFP基因的重组腺病毒质粒DNA的构建：

将步骤1制备的病毒穿梭载体pshuttle2-Math1-EGFP使用PI-Sce1和I-CeuI双酶切，腺病毒表达载体pAdeno-X经PI-Sce1和I-CeuI双酶切后回收，将两者用T4连接酶连接过夜，经SwaI消化后转化大肠杆菌，提取含有目的基因的腺病毒表达载体pAdeno-Math1-EGFP。

3、重组腺病毒的增殖和纯化：

将步骤2制备的腺病毒pAdeno-Math1-EGFP经PacI酶切后转染HEK293细胞。收集病毒，用梯度离心法纯化病毒，并测定病毒滴度。