[发明专利]表达狂犬病病毒糖蛋白(GP蛋白)的重组新城疫LaSota弱毒疫苗株

说明书

技术领域

本发明涉及重组病毒疫苗领域，更具体地，本发明涉及一种表达狂犬病病毒糖蛋白(GP蛋白)的重组新城疫LaSota弱毒疫苗，更具体地，重组新城疫LaSota弱毒疫苗是rL-ERAGP。本发明还公开了制备所述重组新城疫LaSota弱毒疫苗的方法和该重组新城疫LaSota弱毒疫苗在制备预防狂犬病和新城疫的双价疫苗中的应用。

背景技术

狂犬病即疯狗症，又名恐水症，是由狂犬病病毒引起的、侵害中枢神经系统的急性病毒性人兽共患性传染病。几乎所有的温血动物都对狂犬病病毒易感。犬类动物在传播人狂犬病过程中起主要作用，是本病的主要宿主之一。此外，猫、浣熊、狐狸和蝙蝠等也会患病并传播病毒。狂犬病传播途径主要是通过动物咬伤后，唾液中的狂犬病病毒经破损皮肤侵入机体。此外，还可通过消化道、呼吸道以及动物密切接触等途径传播。狂犬病是迄今为止人类病死率最高的急性传染病，一旦发病，病死率可高达100％^[1]。据世界卫生组织报道全世界每年约有3.5万～5万人死于狂犬病，主要分布在亚洲、非洲和拉丁美洲等发展中国家。中国也是受狂犬病危害最为严重的国家之一。

近年来，随着中国家养宠物数量猛增，狂犬病正在重新成为严重危害我国公共卫生的重大疫病。因此，防治狂犬病的形势变得更加严峻。狂犬病的预防主要通过疫苗免疫的方式进行。狂犬病疫苗种类繁多，效果不一。科研工作者一直不间断地对狂犬病疫苗进行改进和创新，取得了丰硕的成果，但仍然存在很多不足^[2～4]。

1885年，法国科学家巴斯德首次用兔脑脊髓制备成狂犬病弱毒疫苗，应用于人体治疗并获得了成功^[6]。我国目前生产ERA株和Flury株活疫苗。狂犬病弱毒疫苗在体内的增殖过程与病原感染机体的过程相似，能诱导产生细胞免疫和体液免疫，且产生的免疫反应较强，持续时间较长，在我国狂犬病防制工作中曾起到一定的积极作用。但有的疫苗毒株本身对乳鼠致病，对怀孕动物、免疫机能不全的动物和幼小动物使用不安全，而且存在毒力回升、返祖的潜在危险。

鉴于弱毒活疫苗在使用过程中存在较大的安全隐患，WHO建议使用狂犬病灭活疫苗代替弱毒疫苗^[7]。主要有神经组织灭活苗、鸭胚疫苗、—细胞培养苗等，由于神经组织疫苗注射量大，接种次数多，抗体产生慢、水平低，含有神经麻痹因子，易引发变态反应，而且疫苗中易残留有感染性的活病毒。鸭胚疫苗抗体效价低，而且需要进行病毒提纯，最终被市场淘汰。细胞苗生产工艺复杂，价格昂贵，同样限制了在生产实践中的广泛应用。

狂犬病病毒的中和抗体表位主要位于病毒糖蛋白上，糖蛋白介导病毒的感染并与病毒毒力直接相关，可诱导机体产生中和抗体；核蛋白的氨基酸序列高度保守，可诱导机体产生细胞免疫^[1]，目前狂犬病基因工程疫苗主要围绕糖蛋白和核蛋白展开^[8～11]，主要有DNA疫苗、亚单位疫苗和重组活载体疫苗等，免疫试验证明具有一定的免疫效果。但由于种种原因，DNA疫苗和亚单位疫苗没能够大面积推广使用。重组活载体疫苗中以痘苗病毒为载体的VRG曾经取得良好的免疫效果。但痘苗重组病毒接种人类后，可长期抑制再次免疫接种，因此狂犬病重组痘苗载体疫苗的使用范围有一定限制。

新城疫病毒(NDV)载体系统是近年进展迅速的活病毒载体系统，作为外源基因的表达载体具有非凡的优势。NDV可同时诱导体液免疫、细胞免疫和粘膜免疫，是所有疫苗形式中最为理想的免疫方式；经过多年的临床应用检验，NDV遗传相对稳定，毒株间发生重组及毒力返强可能性极小，使用安全、方便；NDV具有高滴度的鸡胚生长特性，生产成本低廉，便于规模化生产。以新城疫病毒LaSota株为载体表达H5亚型高致病力禽流感病毒HA基因的活载体疫苗rL-H5株已经上市，在我国高致病性禽流感的防控工作中发挥着重要的作用^[5]。NDV作为疫苗载体具有广阔的应用空间和巨大的经济意义。