[发明专利]猪瘟抗体ELISA诊断试剂盒

说明书

【技术领域】

发明涉及一种猪瘟抗体ELISA诊断试剂盒，属于动物用生物制品制造领域。

【技术背景】

猪瘟又称经典猪瘟(Classical Swine Fever，CSF)，是由猪瘟病毒(Classical swine fever virus，CSFV)引起猪的高度致死性、接触性传染病。是世界粮农组织和各国政府密切关注的 主要传染病之一。根据OIE制定的《陆生动物卫生法典》2005年版，CSF被列为法定报告的 疫病之一，在我国被列为“一类动物疫病”，给我国养猪业带来了巨大的经济损失。

世界各国都将猪瘟防疫列为国家动物卫生行政工作的重点，采取预防、防疫及检疫措施， 以提高养猪产业的收益。在发达国家，以全场扑杀的方式，成功地扑灭猪瘟，成为非猪瘟区； 我国则采取免疫、检疫和淘汰带毒猪的综合防疫措施，促进建立无规定动物疫病区，保证养 猪业迅速、稳定发展，以点带面，从而达到全面消灭猪瘟的目标，因此猪瘟兔化弱毒疫苗依 然是我国用于猪瘟预防控制的唯一手段。通过抗体水平的监测来制定合理、有效的免疫程序 是提高群体免疫水平的保证，为猪瘟的综合防治提供了有力的技术支持。

多年来，人们一直致力于猪瘟抗体检测试剂盒的开发。猪瘟病毒E2囊膜糖蛋白是其的主 要中和性抗原蛋白，它在病毒多聚蛋白上的氨基酸序列为690aa～1063aa，利用该蛋白进行 诊断抗体诊断技术的开发研究一致是人们研究的热点。为了获得猪瘟抗体用诊断抗原，先后 采用了原核表达E2抗原、真核表达E2抗原以及全病毒纯化等各种方法，但各有不同的问题。 主要原因有以下两个方面：①原核表达抗原：表达抗原为包涵体、敏感性差、酶联反应不稳 定；②全病毒纯化抗原：采用过两种方法，一种为硫酸铵沉淀法，另一种为超滤浓缩后超速 离心法，但成本太高、技术难度大、产量极低，猪瘟病毒容易裂解等。在我国建立的方法也 有ELISA方法、血凝抑制试验等，但均存在不稳定的特点。

【发明内容】

[本发明的目的]

是采用基因工程手段，将猪瘟病毒E2基因进行改造以获得蛋白表达量高、稳定性好和免 疫原性特异的可溶性E2蛋白。采取的技术策略是应用基因拼接技术在猪瘟病毒E2基因的两 侧加上分泌信号肽序列和纯化标签，并嵌合至杆状病毒表达载体中，构建重组杆状病毒，获 得可溶性表达抗原，以用于抗体检测试剂盒的组装工作以及猪瘟单克隆抗体的筛选工作。

[本发明的技术方案]

应用基因拼接技术扩增出蜂素肽基因信号肽序列、多肽接头序列及6×HIS序列的融合 序列，并将此序列克隆至载体pFastbacl(Invitrogen公司产品)，构建了一个命名为 pMEL-HIS的载体；

应用基因拼接技术，将猪瘟病毒石门株E2基因(SME2)进行PCR扩增并突变，将突变后的 猪瘟病毒E2基因序列用EcoRI/SalI双酶切，克隆至载体pMEL-HIS，转化筛选、测序鉴定。 将构建的载体命名为pMEL-SE2M-HIS；

将载体pMEL-SE2M-HIS转化大肠杆菌DH10Bac，与菌体中基因组重组后，经挑斑、PCR鉴 定，转染Sf9细胞，产生重组核型多角体病毒，此病毒命名为：苜蓿银纹夜娥核型多角体病 毒(Autographa californica nuclear polydedrosis virus，AcMNPV)(参考黎路林编著.杆状 病毒表达载体系统.武汉华中师范大学出版社出版，p1页)VFBMEL-SE2M-HIS株(2008年9 月26日本病毒株已送交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，编号为：CGMCC No.2671)。将此病毒培养物进行纯化鉴定，获得猪瘟病毒石门株E2基因可溶性表达抗原，此 抗原可用于组装猪瘟病毒抗体检测试剂盒。

[具体实施方案]

一、构建路线：

构建含有猪瘟病毒基因E2基因的重组AcMNPV VFBMEL-SE2M-HIS的pMEL-SE2M-HIS载 体的技术路线(见附图1)。

二、载体构建

1.含信号肽及6×HIS纯化标签载体(pMEL-HIS)的构建

设计4条引物，将信号肽序列、接头序列及6×HIS序列通过应用基因拼接(Gene splicing by over lap extension)技术进行PCR扩增，双酶切(BamHI/KpnI)pFastBacl载体和PCR产 物，连接、转化筛选、测序鉴定。重建的载体命名为pMEL-HIS。