[发明专利]一种恒化高密度培养趋磁细菌高产磁小体的方法

说明书

技术领域

本发明涉及纳米生物技术研究领域，具体地涉及一种恒化高密度培养趋磁细菌，高产磁小体的方法。

背景技术

趋磁细菌是一类在胞内形成纳米磁小体的特殊细菌，其形成的磁小体具有晶型稳定、体积小、有外膜包被而不易团聚等特点，在免疫检测、固定化酶、核酸分离纯化等方面显示出优于其它材料的优势，特别是在肿瘤的靶向和基因治疗上具有重要的应用前景。

但由于趋磁细菌培养困难，难以通过大量培养趋磁细菌获得足够的磁小体用于基础及应用研究，磁小体至今仍未商业化应用。趋磁细菌大量培养的问题主要体现在如下三个方面：(1)培养周期长，根据文献报道的最短培养时间为50小时，最长的达10天之久；(2)由于所使用培养基中碳、氮源浓度的限制，致使培养密度不高，磁小体产量很低；(3)细胞密度和磁小体产量之间的关系有待于进一步协调，在某些条件下细胞密度得到了明显提高，但磁小体的产量并不随之增加。

本发明着眼于上述问题，深入研究了培养基组分、溶解氧等因素对趋磁细菌生长和磁小体合成的影响，摸索出最佳培养条件，实现了通过高密度培养趋磁细菌来大量生产磁小体的目的。

发明内容

本发明的目的是提供一种恒化高密度培养趋磁细菌、高产磁小体的方法，以实现趋磁细菌的高密度培养和磁小体的大量生产。

本发明提供了一种恒化高密度培养趋磁细菌、高产磁小体的方法，它采用深层发酵培养法培养趋磁细菌，发酵培养基中含有碳源、氮源和铁源，在发酵过程中分阶段控制溶解氧在0～2250ppb，并通过补料控制pH值在6.5～7.5。

其中，所述发酵培养基中的碳源是1～30mmol/L的乳酸钠，氮源是3～18mmol/L的铵盐或硝酸盐，铁源是20～500μmol/L的柠檬酸铁。实验证明，相对于硝酸盐，铵盐更有利于细胞生长，因此，所述氮源优选铵盐，如氯化铵。

发酵前期控制溶解氧为5～2250ppb，以促进细胞快速生长；然后随着细胞的生长，溶液内的溶解氧逐渐消耗至0，此后始终控制溶解氧为0，便于胞内磁小体的积累。

发酵过程中pH值的控制范围为6.5～7.5，通过补料调节pH可以实现恒化培养，使发酵培养基中的营养物质始终处于恒定水平，维持细胞的快速生长和磁小体的大量合成，实现磁细菌的高密度培养和高磁小体产量。

其中，所述补料使用的溶液含有铵盐、柠檬酸铁、乳酸钠和乳酸。铵盐优选氯化铵，优选地，补料溶液中各组分的浓度分别为：氯化铵20～100g/L，柠檬酸铁1～10g/L，乳酸钠50～200g/L，乳酸20～200g/L。更优选地，补料溶液中各组分的浓度分别为：氯化铵50～60g/L，柠檬酸铁4～6g/L，乳酸钠100～140g/L，乳酸40～60g/L。

实验证明，低浓度碳源有利于磁细菌细胞的快速生长和磁小体的合成，因此发酵过程中恒定的低浓度乳酸钠对于细胞的快速生长、缩短发酵周期是必要的，且磁小体的大量合成与细胞的强生长能力直接相关。本发明在发酵过程中乳酸钠的总浓度恒定控制在2～20mmol/L，柠檬酸铁的总浓度恒定控制在20～500μmol/L。优选地，发酵过程中乳酸钠的总浓度恒定控制在2～5mmol/L，柠檬酸铁的总浓度恒定控制在80～120μmol/L。

本发明的发酵过程参数控制为：培养温度25℃～35℃，pH值6.5～7.5，搅拌转速50～500转/分钟，通气量0.1～25L/min。

发酵培养前，先将菌种活化，制成种子液。采用的培养基为乳酸钠固体和液体培养基，其组分和配比如下：

乳酸钠液体培养基(以1L计)：

矿质元素混合液           5～10ml

柠檬酸铁(0.01mol/L)      2～10ml

80％乳酸钠               0.1～6.5g

NH₄Cl                0.2～1g

K₂HPO₄               0.5～5g

酵母粉               0.1～5g

MgSO₄·7H₂O          0.1～0.5g

硫代乙醇酸钠         0.01～0.1g

蒸馏水               加蒸馏水至1L。

pH                   6.5～7.5