[发明专利]重组仙台病毒载体的纯化方法

说明书

技术领域

本发明属生物医药技术领域，涉及重组病毒载体的纯化方法，更具体是应用于重组仙台病毒纯化。

技术背景

基因治疗是当今最具发展前景和发展最快的前沿生物技术之一。研究结果表明很多疾病都是由于直接或间接原因基因自身出现异常及功能障碍导致的。随着人类基因组的解析，有关疾病与基因关系的信息越来越多。基因治疗就是把与疾病有关的基因制成药剂导入患者体内，达到治疗疾病的目的。这是一种尖端信息快速转为实用化的最新医疗技术。

一般的基因治疗载体，进入到细胞核内作为DNA来表达目的基因所编码的蛋白。在细胞核内有整合到靶细胞的染色体上，或者与染色体DNA发生基因重组的危险。有报告表明，虽然发生频率极低，但逆转录病毒载体有诱发白血病的可能。另外，已知腺相关病毒载体在被整合的染色体附近，可引起局部的不可逆性的染色体结构变化。因此，在使用这些载体时必须慎重考虑利弊问题。仙台病毒载体是细胞质型RNA载体，对各种动物细胞有较高的感染效率；它本身不进入细胞核内，在细胞质中进行基因表达，在理论上不存在改变细胞核内染色体的危险性，与其他载体相比具有更高的安全性。从根本上解决以往载体存在的生物安全隐患的不足之处。

在临床前研究中，重组仙台病毒载体在重度下肢缺血基因治疗制剂、阿耳茨海默病(早老性痴呆症)疫苗、艾滋病疫苗都表现出了极好的治疗效果。由于仙台病毒载体的基因表达水平很高，可望获得以往载体所不能实现的更好的治疗效果。此外，该载体即使是较少剂量也可发挥相应的治疗效果，相比其他载体需要几十分钟以上的细胞接触才能获得较满意的基因导入效果，重组仙台病毒载体仅在几分钟之内便可完成，在临床上可以减轻患者及医生的負担，是一种非常快捷实用的载体。因此仙台病毒载体有比较广阔的应用前景。

重组病毒在对于所有应用之前，都要在宿主细胞中增殖之后从宿主细胞中进行纯化这一过程。一般的方法包括细胞培养、感染宿主细胞、收获裂解宿主细胞、浓缩粗制裂解物、核酶消化处理、以及进一步层析纯化。大多数改良的方法都集中在选用不同性质的层析介质和超速离心。本发明是利用了仙台病毒蛋白的特点创造性的提出了新的纯化途径，其过程是将收集的病毒初始液与来源于动物的红细胞在低温下混合一定的时间，然后在低温条件下低速离心，收集沉淀；沉淀再用洗液洗涤，洗涤后的沉淀在37℃温浴一定的时间，然后在室温条件下低速离心，收集上清液即为病毒纯品。收集的病毒纯品也可以选用相应的层析介质做进一步的精纯化。

为更好的说明本发明的内容，对仙台病毒的结构做简单的介绍。

仙台病毒(Sendai virus，SeV)属于副粘病毒科副粘病毒亚科、呼吸道病毒属病毒，为单股负链RNA病毒。RNA分子量4.76×10⁶D，病毒粒子多是呈圆形，直径130～250nm。病毒内部由直径约18nm的螺旋状对称结构的核蛋白组成，外包有脂蛋白囊膜，其上有放射状排列的纤突，纤突长8～15nm，宽2～4nm。

仙台病毒的基因结构特点野生型SeV为嗜肺的单股负链RNA病毒，基因组全长15384个核苷酸，编码核蛋(nucleoprotein，NP)、磷蛋白(phosphoprotein，P)、基质蛋白(matrix protein，M)、融合蛋白(fusion protein，F)、血凝素神经氨酸酶(hemagglutinin-neuraminidase，HN)和大分子蛋白(large protein，L)6种结构蛋白和C、V、W等一些非结构蛋白。基因排列次序为3

‘-leader-NP-P/C-M-F-HN-L-leader-5’。其中HN、F蛋白为跨膜糖蛋白，位于病毒表面，形成刺突，又称为刺突蛋白(spiker protein).M蛋白排列在包膜内表面.NP蛋白与病毒基因组RNA结合，形成螺旋状的核衣壳，再结合P蛋白、L蛋白形成核蛋白(ribonucleo-protein，RNP)复合体，构成病毒的核心结构.P/C基因区还包含一个病毒特有的非结构蛋白C的编码区，除非结构蛋白C外，每个基因上、下游各有一个非编码序列R1、R2，对基因表达有特殊的调控功能。SeV RNA3‘端和5’端各有1个51nt和54nt的前导(leader)序列，它们与病毒在宿主内复制及致病有关.

SeV编码蛋白的结构与功能