[发明专利]一种水蛭活性小肽及其制备方法和用途

说明书

技术领域

本发明涉及一种中药水蛭活性小肽及其制备方法和用途。属中药领域。

背景技术

水蛭作为传统中药，始载于《神农本草经》，临床应用很广泛，药效确实。水蛭通常以药 材原粉、水提、醇提或水提醇沉的方式入药，方法比较传统，药材利用率较低；单味或配伍 复方口服给药，治疗心脑血管疾病疗效显著。水蛭中疗效确切的水蛭素类成分口服易失活， 而且只存于日本医蛭等吸血水蛭中，而蚂蟥、柳叶蚂蟥等非吸血水蛭又在临床中口服疗效确 切，说明水蛭中还有另一类活性成分或部位。经现代研究，水蛭小肽确切的疗效成为水蛭的 另一个活性部位，小肽在动物体内以蛋白的形式存在，服用后蛋白经胃肠道内的胃蛋白酶及 胰酶酶解成小肽，再吸收入血发挥疗效；但蛋白在体内酶解成小肽的效率极低，绝大多数 直接排除体外，造成药材的大量浪费，疗效大大降低，而且人体酶解转化蛋白还受到药材粉 碎细度、胃肠道pH变化及口服其他食物的干扰。

水蛭的临床确切疗效及较低的生物利用度，迫切需要一种新的提取方法，提高其生物利 用度。应用酶解法水解动物蛋白，获得具有一定生理活性的生物活性肽是目前国内外研究的 热点，水蛭酶解法制备活性小肽，能充分合理的利用水蛭药材资源，并排除人体对吸入异蛋 白引起的免疫原排异反应，服用更安全，具有广阔的发展前景。

发明内容

本发明的第一目的在于提供一种更有效的，安全的水蛭活性小肽有效部位；本发明的第 二目的是提供该制剂的制备方法及其在制备用于治疗心脑血管疾病药物中的应用。

发明人提供一种水蛭活性小肽有效部位，其相对分子量为0.2KD～3KD，总小肽含量不低 于50％。

本发明的水蛭活性小肽可采用胃蛋白酶酶解、胰蛋白酶酶解、木瓜蛋白酶酶解或仿生酶 解的方法制备，再经精制纯化，并以分子截留值3KD的超滤膜超滤除去大分子的未水解的蛋白、 多肽及角蛋白，其透过液再以分子截留值0.2KD的纳滤膜纳滤，以除去小分子的氨基酸等杂质， 未透过液经浓缩、干燥，即得到本发明的水蛭活性小肽有效部位，其相对分子量为0.2KD～3KD， 经测定其总小肽含量不低于50％。经对相对分子量3KD以上、0.2KD～3KD、0.2KD以下的各部 位进行药效筛选，结果药效成分主要集中在相对分子量0.2KD～3KD范围内，而相对分子量3KD 以上、0.2KD以下部位基本无活性。相对分子量为0.2KD～3KD的水蛭酶解小肽为水蛭的主要活 性部位。

动物药的小肽获取方法有酶解法、酸解法、碱解法，酸解法、碱解法破坏肽的结构，专 属性不强，不易控制，水解过渡成为氨基酸；酶解法专属性强，不同的蛋白酶酶解的肽键部 位不同，如胃蛋白酶主要酶解的部位为苯丙氨酸、酪氨酸和亮氨酸组成的肽键，胰蛋白酶主 要酶解的部位为精氨酸、赖氨酸等碱性氨基酸组成的肽键，有针对性的选择蛋白酶能够得到 理想的小肽，故以酶解法制备水蛭小肽具有较大优势。

以胃蛋白酶酶解、胰蛋白酶酶解、木瓜蛋白酶酶解的方法酶解水蛭，对蛋白中相应的肽 键进行酶解，可得到水蛭活性小肽，其药效远高于水蛭原粉；而仿生酶解法酶解水蛭为发明 人所独创，即模拟人体口服水蛭等动物药的过程，创造性的在体外采用人体仿生酶解的方法， 将水蛭先后以胃蛋白酶、胰蛋白酶在最佳酶解条件下酶解，与直接口服原粉相比，所得的有 效物质群相同，但仿生酶解是最优的酶解条件下酶解的，酶解的更充分，效率高，且经适当 方式去除未酶解的无活性蛋白，不仅增强了疗效，而且消除了服用水蛭粉异蛋白引起的免疫 原反应，减小了不良反应发生率，安全性高，而且其酶解效果比胃蛋白酶酶解、胰蛋白酶酶 解、木瓜蛋白酶酶解好。

胃蛋白酶酶解、胰蛋白酶酶解、木瓜蛋白酶酶解或仿生酶解的方法分别为：

1、胃蛋白酶酶解：取水蛭，加水匀浆，80～85℃保温30分钟，调节pH1.0～3.0，加入 水蛭量1％～3％且酶活力不低于1200U/g的胃蛋白酶，于30～50℃保温酶解2～8小时，80～ 85℃保温30分钟，即得；

2、胰蛋白酶酶解：取水蛭，加水匀浆，80～85℃保温30分钟，调节pH7.5～9.0，加入 水蛭量1％～3％且酶活力不低于2500U/mg的胰蛋白酶，于30～50℃保温酶解2～8小时，80～ 85℃保温30分钟，即得；