[发明专利]表达抗体或抗体类似物的重组克鲁维酵母菌及其构建方法与应用

说明书

技术领域

本发明涉及表达抗体或抗体类似物的重组克鲁维酵母菌及其构建方法与应用。

背景技术

抗体(Antibody，Ab)是一种与抗原特异性结合的糖蛋白。天然抗体约150 000道尔顿，由两个相同的轻链(Light Chain，L)和两个相同的重链(Heavy Chain，H)组成。轻链与重链通过一个共价二硫键相连。每条重链由一个可变区(VH)和多个恒定区组成。每条轻链由一个可变区(VL)和一个恒定区组成；轻链的恒定区与重链的第一个恒定区相对，轻链的可变区与重链的可变区相对。木瓜蛋白酶消化抗体可产生两个相同的抗原结合片段(称为“Fab”片段，每个片段有单个抗原结合位点)以及一个残余的“Fc”片段(可结晶的片段，其分子量大约为50 000)。用胃蛋白酶处理产生一个F(ab’)₂片段，该片段有两个抗原结合位点，并仍能与抗原交联(黄志伟，王琰.抗体工程.第二版.北京：北京医科大学出版社，2002)。

抗体分子的突出特点是其分子结构的双重性：识别不同抗原需要结构上的多样性，与体内效应系统相互作用需要结构的恒定性。这使抗体分子成为体内最复杂的分子，长期以来一直是人们研究的热点。抗体在生物医学领域中的应用极为广泛，其制备技术经历了从多克隆抗血清、单克隆抗体到基因工程抗体等三个发展阶段。

近5年来，随着生物技术的发展，人鼠嵌合抗体、人源化抗体和人抗体技术及制备技术的成熟，基本上克服了鼠源性抗体在人体应用时产生抗抗体的问题；同时由于在人鼠嵌合抗体、人源化抗体和人抗体中采用人的Fc片段，在人体内的半衰期从鼠源性抗体的小于20小时到人源化抗体和人抗体的半衰期为数天、甚至到21天之久。同时，抗体库的建立和筛选以及多价重组抗体制备技术的发展使人们能够直接获得特异性强、亲和力高的单克隆抗体，如SLAM法(Selected Lymphocyte Antibody Method)制备的抗体的亲和力比杂交瘤技术制备的抗体的亲和力提高1000倍。抗体技术的发展使导向治疗研究走出低谷，并在近几年取得了突破性进展，应用抗体治疗疾病初显曙光(陈志南，刘民培.抗体分子与肿瘤.北京：人民军医出版社，2002)。

但目前对于抗体治疗疾病仍存在着两个难题：一是由于治疗疾病的抗体需要量极多，目前的生物工程生产比较困难，同时由于需要量极多，要求其产品纯度极高，因此产品生产成本高、产品价格昂贵。二是对于很多疾病而言，需要抗体长期应用，才能达到治疗疾病的目的。以美国批准上市的治疗肿瘤的人源化抗体Rituxan和Herceptin为例，Rituxan一个疗程约需用药1.2g，Herceptin一个疗程约需用药0.88g；而抗vEGF人源化抗体，一个病人的最大用药量甚至达到了7.8g，这些抗体类生物制品比细胞因子类生物制品用药量高出了几万倍(黄志伟，王琰.抗体工程.第二版.北京：北京医科大学出版社，2002)。

在抗体研究中，小分子抗体成为研究的热点。通过保留抗体上的抗原特异性结合区域，构建获得无Fc段、分子量较小、具抗原结合功能的分子片段的小分子抗体，其易于穿透血管壁和组织屏障进入病灶，有利于肿瘤的诊断和治疗；免疫原性强，可作为载体分子偶联多种活性蛋白基因如酶、毒素等用于疾病的导向性治疗，且不需进行糖基化修饰，可在大肠杆菌中表达。小分子抗体可改善抗体的药代动力学特性，并适合于临床的应用。这种经改造后的小分子抗体，根据其价数的不同可分为单价及多价两种。单价小分子抗体根据构建的方法不同，可分为Fab抗体、单链抗体、二硫键抗体、单域抗体和超变区多肽。在ScFv的基础上，可以把两个或两个以上的ScFv重组在一起，由此可制备成多价的小分子抗体即微型抗体(简称多价微抗)。其中包括双链抗体(diabody)，双特异性抗体(bispecific antibody)，微型抗体(minibody)，三链抗体(triabody)及四链抗体(tetrabody)等(李智华.基因工程抗体研究进展.云南医药，2004，(25)1：74-78)。