[发明专利]竞争性酶联受体亲和反应筛选雌激素活性化合物技术

说明书

技术领域

本发明专利属于分析测试技术领域，涉及一种快速筛选雌激素活性化合物的技术。本技术在环境污染物的毒理学研究、化合物代谢产物研究、工业品的毒性评价、药物筛选及有效成分分析等方面有广泛的应用前景。

背景技术

环境污染物对健康的影响是人们普遍关注的问题。近年来，越来越多的曾被认为“安全”而广泛使用的化合物被证明具有雌激素或抗雌激素活性，能够引起一系列雌激素依赖的生理、生化过程紊乱，导致实验或野生动物的胚胎发育异常、生殖能力下降、性别分化异常等现象。虽然这些化合物对生物体的作用途径、生物效应各不相同，但一般都需要与雌激素受体发生相互作用。

在生物体内，雌激素与雌激素受体的相互作用机制一般为：首先雌激素与雌激素受体结合，然后受体蛋白形成二聚体，最后此二聚体与目标基因上的雌激素响应元素(estrogenresponse element，ERE)结合，激活目标基因的表达，使细胞产生相应生理响应。从雌激素受体蛋白的N端到C端包括6个不同的结构域，依次命名为A-F，结构域E有配体结合功能，称为配体结合区(ligand binding domain，LBD)。为研究方便，通常用异源表达的LBD蛋白研究配体与受体的相互作用。生物体内主要有两种不同的雌激素受体蛋白，分别称为ERα和ERβ。不同组织中ERα和ERβ的比例不同，对配体的亲和活性及转录活性也不相同。

由于雌激素活性化合物一般环境剂量低且作用机制复杂，其对生物体的影响难以用传统的物理化学测试结果进行准确评估。为此，开发基于雌激素受体——配体相互作用的雌激素活性化合物快速筛选技术具有重要意义。虽然，已有利用雌激素受体研究化合物的雌激素活性的报道，但绝大多数报道中均采用氚标记的雌二醇作为竞争配体，通过其与雌激素受体结合后放射性活度的变化来评价化合物与雌激素受体的结合活性。这种方法虽然准确度高，但是由于试剂昂贵，且需要进行放射性操作，所以一般实验室难以进行。目前，与本发明相似的竞争性酶联受体亲和反应筛选雌激素活性化合物技术未见报道。

发明内容

本发明专利是一种基于雌激素受体——配体相互作用的竞争性雌激素活性化合物快速筛选技术。其基本原理是将测试化合物、固定化17β雌二醇与雌激素受体蛋白ERα-LBD或ERβ-LBD置于同一反应体系中，使测试化合物、固定化17β雌二醇竞争性与ERα-LBD或ERβ-LBD结合，最后通过酶联反应检测结合在固定化17β雌二醇上的雌激素受体蛋白数量对测试化合物的雌激素活性作出评价。

本发明专利是通过下述技术方案而实现的。

1、雌激素受体蛋白ERα-LBD或ERβ-LBD的制备。将ERα-LBD或ERβ-LBD质粒(100μL)转移到含感受态细胞(100μL，溶于0.1mol/L的CaCl₂)的离心管中，冰浴30分钟，于42℃水浴放置90秒，再入冰浴，加入LB液体培养基500μL，混匀后振荡培养(100rpm，37℃)45min，最后将上述菌液涂固体LB平板，37℃过夜。将ERα-LBD或ERβ-LBD质粒转化的宿主菌接种于含Amp+(100μg/mL1)的液体LB培养基(5mL)，过夜培养(37℃，200转)。过夜培养物按4％接种比接种到含Amp+(100μg/mL)5ml液体LB培养基，通气培养(37℃，200转)，直到在600nm下，OD为0.5-0.7时加入IPTG，工作浓度为0.2mmol/L，温度25℃，振荡培养时间为：8小时，室温离心(10000rpm，10min)弃上清。把沉淀重悬于结合缓冲液中(0.5M NaCl，20mM Tris-HCl，5mM吲唑，pH7.9，每100mL培养基10mL缓冲液)，加入蛋白酶抑制剂，用超声波破碎仪破碎细胞(功率450W，工作时间3S，间隔时间3S，总时间6min)。将破碎液离心后(12000rpm，20min)，依次用3倍体积去离子水，5倍体积NiSO₄(0.05M)，3倍体积结合缓冲液平衡His-Bind亲和萃取小柱。使上清液以10mL/h速度流过亲和萃取柱。先用10倍体积结合缓冲液冲洗萃取柱，然后用6倍体积洗涤液(0.5M NaCl，20mM Tris-HCl，60mM吲唑，pH7.9)冲洗。用6倍体积洗脱液(0.5M NaCl，20mM Tris-HCl，1M吲唑，pH7.9)洗脱，收集洗脱液，用Tris-HCl(20mM，pH7.5)透析后，用超滤离心管浓缩至200μl，加入蛋白酶抑制剂，-80℃保存。