[发明专利]东北林蛙及其卵油的分子鉴别方法

权利要求书

1、东北林蛙及其卵油的分子鉴别方法，其特征在于：该方法是一种以PCR技术为基础，筛选特异引物进行扩增，实现对东北林蛙和卵油的分子鉴别，具体实现步骤为：

(1)基因组DNA提取：

①称取组织样品100～500mg，剪碎，放入灭菌的1.5ml的EP管中；

②加入600μl 1×SET液、浓度为10mg/ml的蛋白酶K20μl、25μl SDS，温度在55℃的条件下，空气浴2小时；

③加500μl Tris饱和酚和200μl TE上下颠倒10分钟；

④以10000转/分钟，离心10分钟，吸上层水相，下层去掉；

⑤加入等体积的酚:氯仿:异戊醇＝24:23:1，再补加200μl TE混合10分钟；

⑥以10000转/分钟，离心10分钟，吸上层水相，下层去掉；

⑦加入等体积的氯仿:异戊醇＝23:1，再补加200μl TE混合10分钟；

⑧以10000转/分钟，离心10分钟，吸上层水相，下层去掉；

⑨在-20℃温度下预冷，加入2倍体积的无水乙醇，水平摇动30次，用枪头挑出白色DNA沉淀；

⑩加入700μl 70％的冷乙醇，以8000转/分钟，离心5分钟，倒掉乙醇，自然干燥；

加入TE溶液50～100μl，置于55℃水浴3～4小时；

在4℃下保存。

(2)基因组DNA检测与浓度测定

用紫外分光光度计测定DNA浓度：根据记录的OD260/280比值，估测DNA质量，OD260/280在1.6～1.8之间，可以满足试验要求；根据记录的OD260数值及测试液稀释倍数，换算出DNA的浓度。对DNA原液作相应的稀释，以50ng/μl分装，作为工作液4℃保存使用。

(3)PCR扩增

采用特异引物(F：5′-GCC TTT CTA CCG CAA ATA-3′；R：5′-AGG TGCTTT TTT TCT GGG-3′)于PCR仪中进行扩增。

(4)特异扩增产物鉴别

扩增产物经1.2％琼脂糖凝胶电泳检测，100V恒压，EB染色；在凝胶图谱分析系统上观察和分析，并记录结果；东北林蛙及卵油基因组DNA在1000bp处扩增出特异条带，无性别和个体差异，作为东北林蛙及卵油鉴别的特征谱带。

2、根据权利要求1所述的东北林蛙及其卵油的分子鉴别方法，其特征在于：所述PCR扩增反应总体积为25ul，其中包括以下各组分：10×PCR buffer为2.5μl，10mmol/L dNTP为2.0μl，Primer(F)10pmol/μl为1.0μl，Primer(R)10pmol/μl为1.0μl，Taq DNA polymerase为0.2μl(1U)，Template为2.0μl(50ng/μl)，Autoclaved，distilled water为16.3μl。

3、根据权利要求1所述的东北林蛙及其卵油的分子鉴别方法，其特征在于：所述PCR扩增反应程序为，在94.0℃预变性7min，然后进入如下循环：94.0℃变性50s、56.9℃复性1min、72.0℃延伸1min，循环35次，循环结束后72.0℃再延伸10min。