[发明专利]提高大型真菌子实体DNA提取成功率的样品处理方法

说明书

技术领域

本发明涉及对大型真菌子实体的采集后处理方法，该方法可以提高从大型真菌子实体中提取DNA的成功率，具体地说是提高大型真菌子实体DNA提取成功率的样品处理方法。

背景技术

大型真菌DNA的提取是进行系统发育关系研究的必要途径。进行DNA提取所用的材料通常有有2种：一是野外对大型真菌进行分离培养，得到菌株后利用菌丝体进行DNA提取；二是利用大型真菌的子实体直接研磨后进行提取。森林生态系统中大型真菌种类达数千种，其中有些种类可以进行人工培养，可以比较容易地获得菌丝体。而有的种类，特别是外生菌根真菌，如：牛肝菌等食药用真菌，由于这类真菌属于活体共生菌，必须与植物进行共生才能生长繁殖，离开活体植物后很难生长发育出子实体，也不易获得菌丝体。因此，对这类大型真菌的分子系统发育研究通常采用子实体分离得到的DNA。现有的标本处理程序采用直接晾晒或烘干真菌子实体的方法，由于种种原因，特别是菌组织脱水过程中造成DNA降解，多数样品DNA的提取率和完整率都较低。

发明内容

本发明的目是提供一种在野外对大批量大型真菌子实体样品进行采集后处理的方法，采用该方法后可以大大提高大型真菌子实体DNA提取的成功率。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种提高大型真菌子实体DNA提取成功率的样品处理方法，

1)在实验室内，取一定数量的体积为2-7ml旋盖离心管(视需要的数量而定)，注入离心管1/2-3/4体积的蒸馏水，旋紧盖，置于试管架上，于121℃的高压锅内进行高温湿热灭菌，时间25-30分钟。灭菌完成后取出离心管，放入离心管盒，备用。

2)在野外将大型真菌用采集刀取下，去掉受污染的子实体部分(木生真菌，如灵芝)、和/或切除其根部与寄生体或泥土相连的部分(地生真菌，如蘑菇)，将保持清洁的子实体装入灭菌后的羊皮纸袋内带回；

3)将子实体菌盖用无菌解剖刀切开，切取子实体内层2-10块0.2-1cm³组织块放入备用的装有无菌蒸馏水的2-7ml旋盖离心管内，旋紧离心管上盖，室温保存，可保存1-2月。

4)带回实验室可采用液氮研磨的方法，或加入裂解液和硅胶颗粒进行机械粉碎破壁，即可用于提取DNA。

所述大型真菌为木生或地生带有肉眼可见子实体的真菌；包括能进行组织分离培养的种类和不能进行分离培养的外生菌根菌。

所述离心管内放入无菌蒸馏水的体积为离心管体积的1/2-3/4。

所述子实体内层是指子实体去掉表皮和表层的内部(未污染)组织。

所述灭菌是指在高压锅内121℃蒸气灭菌25-30分钟。

本发明具有如下优点：

1.采用本发明方法主方案可以使大型真菌子实体组织提取DNA的成功率达到90～100％(视大型真菌种类和其具体生物学特性而不同)，而采用通常方法进行处理的真菌子实体其提取成功率只有10-30％。

2.适用范围广，对能够进行组织分离培养的种类，还能对无法在人工培养基上生长的大型真菌种类，进行子实体处理；对木生真菌和地生真菌不同类群都可以应用该方法；对质地为木质、革质、木栓质的大型真菌，或是肉质的蘑菇类真菌都可适用。

3.本发明尤其适于野外作业时，对大量真菌子实体样品的采集与预处理。

具体实施方式

实施例1.

在野外将地生大型真菌地花孔菌(Albatrellus syringae)用采集刀取下，切掉受污染的子实体部分根部与泥土相连的部分，将保持清洁的子实体装入灭菌后的羊皮纸袋内带回室内。将地花孔菌子实体的菌盖用无菌解剖刀切开，切去上表皮及下表皮厚度各0.2cm的外层组织，露出洁净的菌盖组织，用刀横向及纵向切取子实体块，呈大小约0.3cm³的菌组织块，取至少3-4块菌组织块放入备用的2ml旋盖离心管内，管内预先装有1.2～1.5ml经过121℃高温湿热灭菌30分钟的无菌蒸馏水，旋紧离心管盖，带回实验室常温保存。

在需要时取出样品，可采用液氮研磨菌组织块的方法用于提取DNA；或倾倒去原有的无菌蒸馏水，加入真菌细胞裂解液和硅胶微颗粒进行机械粉碎破壁，进行DNA提取。

采用该方法，在野外采集30组样品，于室温保存2周左右后回到室内，加入细胞裂解液并用硅胶颗粒进行机械破碎，DNA提取成功30组，成功率达到100％。

实施例2.