[发明专利]一种从血清代谢轮廓筛选恶性卵巢肿瘤标志物的方法

权利要求书

1.一种从血清代谢轮廓筛选恶性卵巢肿瘤标志物的方法，其特征在于：采用超高效液相色谱-质谱联用技术对血清进行分析得到血清代谢轮廓；然后用多变量统计方法分析恶性卵巢肿瘤和正常人血清代谢轮廓数据，筛选标志物谱。

2.根据权利要求1所述方法，其特征在于；所述获取血清代谢轮廓的具体步骤如下，

1)取在相同条件下收集的n个恶性卵巢肿瘤患者和m个健康人的血液，血液分别置于负压管中，离心15分钟后取上清液，即为所需的n+m个血清样品；n为≥10的正整数，m为≥10的正整数；

2)血清样品预处理：于血清样品中分别加入其3-5倍体积的乙腈沉淀蛋白，于0-4℃12000-15000g离心8-12分钟，上清液冻干重溶于2/3-4/3血清样品体积的水/乙腈v/v为1/3-1/5的溶液中，得n+m个样本；乙腈沉淀蛋白的过程中，体系内加入有3ng/μl的亮氨酸脑啡肽作为内标；

3)对n+m个样本依次进行超高效液相色谱质联用分析；

液相条件为：色谱柱为Acquity C18柱，柱温35℃，进样量1-10μL，流动相A为体积浓度0.1％甲酸溶液，B为乙腈；梯度洗脱条件：0～0.5min为98％A相，2～24.5min线性变化至100％B相并保持3.5min，再切换98％A并保持2min；流速0.35mL/min，柱后流出液不经分流直接导入质谱系统检测；

质谱条件为：电喷雾离子源(ESI)，采用正离子模式检测；脱溶剂气流量为400-600L/h，脱溶剂气温度为280-300℃，锥孔气流量为50L/h，脱溶剂气和锥孔气均为高纯氮气；离子源温度120℃，毛细管电压为3100V，锥孔电压为35V，微通道板电压为2800V；每0.48秒采集一次数据；质量扫描范围m/z 100～920，获得被分析样本的总离子流图；最终得到n+m个样本的总离子流图，其即为血清代谢轮廓谱。

3.根据权利要求2所述方法，其特征在于：于n+m个样本中随机抽取一个样品或一个以上样品的混合物为质量控制(QC)样，作为质谱检测过程中的质量控制标准，在对n+m个样本依次进行超高效液相色谱质联用分析过程中，先将QC样进样一次，然后每分析4-8个样本后，再将QC样进样一次，通过分析QC样总离子流图，来监控实验过程中超高效液相色谱质联用仪有无较大系统偏差，确保数据的可靠性。

4.根据权利要求2所述方法，其特征在于：步骤1)中获得的血清样品可储存于超低温-80℃的冰箱中，备用。

5.根据权利要求1所述方法，其特征在于：采用LC-MS数据处理软件对n+m个样本的血清代谢轮廓谱进行峰提取，然后进行峰匹配，形成一个数据矩阵，数据矩阵用偏最小二乘-判别分析(PLS-DA)方法进行统计分析，对恶性卵巢肿瘤患者以及健康人血清的代谢轮廓数据进行建模，根据模型中的变量重要性因子筛选对分类贡献最大的5个或5个以上的检测离子，这些检测离子对应的代谢物可被认为是在恶性卵巢肿瘤代谢产生影响的生物标志物谱。

6.根据权利要求1所述方法，其特征在于：对筛选出的标志物谱进行判别分类(discriminant)分析，计算判别正确率和阳性检出率；然后对筛选出的标志物谱进行结构鉴定。