[发明专利]一种纳豆激酶固体发酵方法

说明书

技术领域

本发明属于微生物技术领域，涉及纳豆激酶高产菌株和纳豆激酶的 固体发酵方法。

背景技术

纳豆激酶属于丝氨酸蛋白酶类，1987年日本学者须见洋行在纳豆 中发现了这种与血栓溶解酶相类似的酶，将其命名为纳豆激酶 (Nattokinase，NK)。纳豆激酶通过直接溶解人体内的血纤维蛋白，刺激 静脉内皮细胞产生纤溶酶原，促进内源性t-PA的产生，从而有效地发 挥溶栓效果。须见洋行后来证实，纳豆激酶经食用到血液内后在5-8小时 的长时间内也很稳定，是一种安全、高效的具有纤溶活性的酶制剂。之 后的很多研究相继证明了纳豆激酶可以用作针剂、口服用的溶栓治疗， 亦可用于保健品，是很有潜力的溶栓制品。

纳豆激酶的生产方法主要以发酵为主，现行的发酵工艺有液体发酵 和固体发酵，其中液体发酵使用的较多。最早的纳豆激酶液体发酵是用 野生的纳豆菌，发酵产物中纳豆激酶的产量极低，提取工艺复杂，并且 野生纳豆菌的性能很不稳定，对纳豆激酶的生产产量和成品质量影响很 大。近些年来，不同的液体发酵方法多见报道，比如申请号为02116667 的发明专利申请、申请号为02121352.6的发明专利申请、申请号为 200610129353.7的发明专利申请、以及《纳豆激酶液态发酵工艺优化》 和《纳豆菌B-12产纳豆激酶条件及酶学性质研究》等文章，分别介绍 了不同的液体发酵制备纳豆激酶的方法，所用主要原料有大豆、玉米粉、 酵母膏、大豆蛋白胨、多糖类物质、蛋白胨查氏琼脂、桑塔斯琼脂、牛 肉浸汁琼脂、黄豆粉琼脂或葡萄糖酵母精琼脂等有机培养基，有些研究 中还加入某些无机离子甚至中药。这些方法所用原料成本较高，酶活也 都不很理想，现有报道液体发酵单位产纳豆激酶活性最高的实验室结 果，其单位发酵酶活可以达到4300IU/mL。而现有固体发酵生产纳豆激 酶的方法酶活在几百到两千IU/g不等，因此纳豆激酶实现大规模产业 化生产受到一定的限制。

本发明的目的是针对上述纳豆激酶制备上的不足，提出一种采用自 己筛选的纳豆激酶高产菌株，进行纳豆激酶固体发酵的方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种纳豆激酶的固体发酵方法，采用自选纳 豆激酶生产菌株dcfu001，以豆渣为培养基进行固体发酵，经灭菌—接 种—发酵—干燥而成，所用豆渣可以是鲜豆渣或干豆渣。

本发明所用纳豆激酶生产菌株为从市售豆豉中筛选得到的高产菌 株，经生理生化分析和16sRNA鉴定，确定为枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)，属于益生菌菌株，定名为dcfu001。该菌株于2008年9月9 日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会的普通微生物中心 (CGMCC)，保藏号为2663。

本发明的目的通过以下技术方案达到：

1.dcfu001的分离和鉴定

1)分离：

选取市售豆豉为原料，按如下方法分离出不同产品中的纳豆激酶产 生菌：取待分离样品10克，加入100mL灭菌水中，振荡，100℃沸水 浴5分钟，静置片刻后取上层混浊液100μL，加入900μL灭菌水为10^-1， 依次稀释到10^-3；同时制作LB平板。分别取10μL不同稀释度的溶液加 到LB分离平板上，用玻璃刮铲涂布均匀，37℃倒置培养24小时，挑取 单菌落进行两次划线培养。挑取LB平板上的单菌落点种在血纤维蛋白 平板上，37℃培养18小时，测量溶解圈大小。最后取从5种产品中分 离出的单菌落进行纤溶活性检测，获得2号菌株纤溶活性最高。

2)鉴定：

形态观察

在37℃培养24小时的LB平板上，2号菌株的菌落呈规则的圆形， 边缘微有叶状齿，不透明。挑取单菌落，置载玻片上的生理盐水中，涂 匀，风干后进行固定，经革兰氏染色后观察菌体形态。观察结果表明菌 体呈短小杆状，长3.0-4.0μm，宽0.8-1.0μm，革兰氏阳性，染色均匀， 可以形成芽孢，芽孢中生，椭圆形。

3)生理生化性质鉴定

参照伯杰氏细菌学鉴定手册对2号菌株的生理生化性质进行鉴定， 结果如表1所示

表1.2号菌株的生理生化特征

4)16SrDNA分子测序鉴定