[发明专利]煤矿酸性矿井水底泥DNA提取方法

说明书

技术领域

本发明涉及DNA的提取与纯化，具体涉及煤矿酸性矿井水底泥DNA提取方法，属于分子生物学技术领域。

技术背景

煤矿在开采过程中，因含煤地层中所含硫化物(主要为黄铁矿)的赋存环境变化而自发进行氧化还原反应，可导致产生酸性矿排水。酸性矿排水具有低pH值和较高的矿化度特征，有很强的溶解性和侵蚀性，这种矿排废水能携带大量的重金属及有害化学物质进入环境。煤矿酸性废水中的一些有害物质还会在河流底泥中沉积，底泥中各种污染物长时间释放同样又会影响下游水体的水质。目前对煤矿酸性废水影响河流水质方面进行了较多的研究。

微生物对煤矿酸性废水中的一些有害物质可以产生吸附、转化、降解、富集等作用，目前微生物分子生态学微生物分子生态学作为分子生物学与微生物生态学交叉而形成的学科，在环境科学方面广泛应用。分子生态学实验技术可以了解微生态系统中微生物群体结构、多样性及其功能相关性，了解体系中微生物具有的重要作用，从而进一步利用生物强化手段，处理还击污染问题。目前，煤矿酸性废水底泥的微生态研究很少，主要原因是国外DNA提取试剂盒价格昂贵，采用自配试剂又难以脱除底泥中的PCR(DNA聚合酶链式反应)抑制因子(如腐殖酸等)，且不能对微生物宏基因组DNA完整提取，不能完整了解煤矿酸性废水底泥微生物的群落结构。目前有关DNA提取的专利有公开号：CN1401782，CN1420124，CN1198439，CN101148664，CN101173274，CN101230342等。国外DNA提取相关专利有：IPC：C12Q1/68；C12Q1/68；IPC：C12M1/18；C12Q1/68；C12M1/16；(+1)，IPC：A61K39/04；C12N1/21；C12P21/00；(+5)等。

本专利是提供一种采用助剂洗脱微生物，膜过滤，细菌裂解的微生物DNA提取方法，本方法未见报道。利用本专利，可以加深对煤矿酸性废水底泥的微生态了解，有助于对煤矿酸性废水中一些有害物质进行原位生物处理。

发明内容

本发明的目的是应用生物化学，分子生物学技术，提供一种能够高效提取纯化煤矿酸性矿井水底泥DNA的方法，以解决常规DNA提取试剂盒对煤矿酸性矿井水底泥DNA提取效率不高，必须进行DNA后续纯化工作并且提取产物腐殖酸类物质较多，影响后续的PCR等分子生物学操作的问题，以便更好的应用于煤矿酸性矿井水底泥多样性的分子生态学研究。

本发明是通过以下技术方案来实现上述发明目的的。

本发明为煤矿酸性矿井水底泥DNA的提取与纯化方法，具体方法为：

1.煤矿酸性矿井水底泥微生物样品的收集

收集煤矿酸性矿井水底泥样品加入洗脱液，加入含有吐温(吐温80或40)pH5.0-7.0的磷酸缓冲洗脱液，37℃恒温振荡30分钟，超声波振荡5分钟，低转速离心，大量菌体留于上清中。

2.膜过滤收集菌体：0.5μm膜过滤上清，菌体停留于膜上。

3.DNA的提取

带膜菌体加入裂解缓冲液(100-200mM Tris-HCl[pH8.0]，50-100mM EDTA[pH8.0]，50-100mM sodium phosphate[pH8.0]，1.0-1.8M NaCl)，同时加入蜗牛酶，溶菌酶，使其终浓度均在10ng/ml-100ng/ml。37℃恒温振荡20-60分钟，再加入蛋白酶K，使其终浓度均在10ng/ml-100ng/ml，37℃恒温振荡20-60分钟，取出加入SDS溶液，使SDS终浓度为0.4-1.2％，60℃恒温30-60分钟，每十分钟剧烈震荡30秒。加入等体积氯仿∶异戊醇(V/V 24∶1)于提取液中，6000-8000g离心5-20分钟，吸取上清。加入三分之二体积异丙醇室温15-30℃静置2-6小时，10000-12000g离心10-20分钟，弃上清，70％乙醇洗涤两次，无菌环境下干燥。

具体实施方式

1.煤矿酸性矿井水底泥样品中微生物的收集

选定煤矿酸性矿井水底泥位点，五点取样法取煤矿酸性矿井水底泥，加入100ml含有吐温(吐温80或40)pH5.0-7.0的磷酸缓冲洗脱液，37℃恒温振荡器振荡30分钟，超声波振荡6分钟，每隔两分钟拿出剧烈摇匀，收集超声波振荡后的悬浊液，1000g离心10分钟，收集上清。

2.膜过滤菌体：

0.5μm膜减压抽滤，收集膜。

3.破裂细胞