[发明专利]肿瘤血管靶向性肽新型肿瘤坏死因子融合蛋白

说明书

技术领域

本发明属于医药生物技术领域，具体涉及基因克隆、外源基因在原核细胞中的表达、目的蛋白质的纯化、肿瘤血管靶向性肽新型肿瘤坏死因子融合蛋白。

背景技术

肿瘤血管抑制治疗相关研究及存在的问题：

肿瘤血管生成是肿瘤迅速增殖的前提条件，抑制肿瘤血管生成是肿瘤治疗的一种重要途径。目前肿瘤血管抑制治疗主要分为以下途径：①阻断促进血管生成的调节因子。血管生长刺激因子VEGF等是肿瘤细胞中最常发现的促血管生长因子，也是血管治疗中的主要靶分子。②增强抑制血管生长的调节因子。如增强抑制性细胞因子、生长因子拮抗剂等是肿瘤血管治疗中最直接的手段，目前已有多种抑制调节因子进入临床前期试验阶段。③已形成血管的阻断疗法。诱导肿瘤组织中已存在的血管急性损伤能够有效抑制肿瘤的增殖。④肿瘤血管抑制基因治疗。由于基因治疗的目标是核酸，具有设计简单、特异性强和毒性小等优点，目前已广泛用于实验研究中。

尽管目前在肿瘤血管生成方面的研究取得了很大的突破，但仍存在不足之处。首先，肿瘤血管针对性治疗不强。由于检测肿瘤血管特异性的分子标志物存在着很多困难：这些分子只存在于肿瘤血管，正常血管中并不存在；表达的量较小，难以检测，更无法纯化。找出肿瘤血管特异性标志物是对肿瘤血管进行靶向治疗的关键。其次，目前进入临床实验多数血管生成抑制分子进入体内表达效率低，不能在肿瘤血管局部维持治疗浓度。只有当这些抑制血管或者肿瘤生成的药物具有靶向性的时候，才能使药物在体内表达效率增高，治疗浓度增大，达到有效治疗。

特异性结合多肽的研究现状：

针对以上的不足，噬菌体随机肽库的应用成功的解决了这一难题并为人们大规模发展和筛选新型抗肿瘤药物提供了强有力的手段。随着噬菌体展示多肽库技术的发展，应用小肽模拟抗原抗体反应已成为发展的趋势。这是因为：(1)含有关键残基的短肽能够模拟蛋白质上的抗原决定簇；(2)多数情况下，几个关键残基与它的结合分子所形成的非共价键构成了全部结合的主要部分，即蛋白质之间的相互作用是通过局部肽段间的相互作用实现的。这类导向性药物，不仅具有结合特异性和高效性，还克服了单抗效应剂分子量较大，穿透能力弱的缺点。目前，基于导向药物中导向分子小型化的发展趋势，利用噬菌体展示多肽库技术筛选出能够与目的分子结合的短肽，在体外合成编码这一短肽的核苷酸序列，与弹头分子基因融合，表达出具有导向作用的多肽—弹头分子，由短肽发挥导向作用，弹头分子可以是细菌毒素、细胞因子、化疗药物等，这一药物设计策略已显示出良好的应用前景。

已有研究显示各种组织器官都存在着组织器官特异性亲和蛋白，因此不同种类的肿瘤血管也会有不同的特异性亲和蛋白，即“异质性”(Molecular heterogeneity)。Pasqualini等人也通过噬菌体随机肽库体内淘洗法并获得了包括脑、肾、肺、胰、皮肤等多种正常组织器官血管内皮结合的不同的噬菌体短肽。Wadih Arap等采用噬菌体随机肽库技术发现能够与前列腺肿瘤血管特异性结合的小肽“SMSIARL”。

Angelo Coni等利用基因工程手段，将从噬菌体展示肽库中筛选出的能特异性与氨肽酶(CD13)结合的五肽CNGRC通过一个甘氨酸连到天然人肿瘤坏死因子的氨基端，实验证明，改建后的融合蛋白在体外肿瘤细胞杀伤实验中具有与天然肿瘤坏死因子相近的活性，在体内实验中，与天然肿瘤坏死因子相比，改建后的融合蛋白具有更高的量效比，更低的毒副反应。在移植肿瘤生长12天以后，CNGRC-TNF和TNF二者的杀伤活性出现明显差别，说明CNGRC-TNF可能通过作用于肿瘤的新生血管而具有较高的量效比。证实了特异性结合多肽作为导向分子的合理性和可行性。目前筛选多肽的方法有体内筛选和体外筛选两种，体外筛选主要针对目的肿瘤或组织的细胞系进行筛选，方法比较简单，但是无法准确模拟体内环境，筛选出的多肽在应用到体内时靶向效果不好。体内筛选就弥补了这个不足，体内筛选要建出合适的动物模型，方法上比较复杂，但是其来源于体内环境，应用于体内时效果较好。

肿瘤坏死因子是一种多功能的细胞因子，参与机体的免疫代谢调节，对某些癌细胞具有增殖抑制和细胞毒作用。肿瘤坏死因子还是一种感染性介导因子，在机体的炎症中起重要作用。

肿瘤坏死因子的生物效应：