[发明专利]一种以橙色大白菜子叶段为外植体的离体组织培养方法

说明书

技术领域

本发明属于农业技术领域，是以橙色大白菜子叶段为外植体的不定芽诱导和植株再生的培养方法。 

技术背景 

大白菜起源于我国，南北都有种植，具有悠久的栽培历史，是人们生活中不可缺少的一种重要蔬菜，味道鲜美，营养丰富，素有“菜中之王”的美称，为广大群众所喜爱。橙色大白菜由西北农林科技大学园艺学院蔬菜花卉研究所白菜课题组提供，中晚熟，结球紧实，粗纤维少，含糖量高，味甜，口感佳，营养丰富，商品性好，高抗病毒病，霜霉病和干烧心。 

通过基因工程技术创新大白菜种质和新品种具有直接、快速和针对性强的优点。建立高效稳定的再生体系是大白菜遗传转化的前提，同芸苔属其它作物相比，大白菜属十字花科AA基因组作物，而A基因组对再生芽的抑制效应较大，主要存在材料特异性强、重复性差、周期长和再生频率低等问题，制约转基因技术在大白菜种质和品种改良上的应用。前人报道了大白菜子叶、子叶-子叶柄、真叶、下胚轴、花相关组织、小孢子和原生质体直接分化再生、愈伤组织再生、胚状体再生和原生质体再生等多种途径。其中子叶-子叶柄离体繁殖为直接器官分化途径，可以直接诱导再生芽，明显缩短培养周期，然而报道中芽诱导培养基添加物种类繁多，一般认为AgNO₃不可缺少，为提高芽分化率还添加了Co(NO₃)₂、CoCl₂、GA₃、ABA等物质；而且采用的外植体苗龄大小差异很大，3～15d不等；外植体切割方式报道很不一致，关于保 留两片子叶，在子叶柄基部和下胚轴交接处(即生长点处)，横切后去除顶芽，切除两片子叶顶端的方式尚未报道。 

发明内容

针对现有技术中存在的问题与缺陷，本发明的目的在于提供一种以子叶段为外植体的橙色大白菜离体组织培养方法，该方法有效的解决了培养周期长和再生频率低的问题。 

实现上述发明目的的技术方案是一种以子叶段为外植体的橙色大白菜离体组织培养方法，其特征在于，具体包括下列步骤： 

1)挑选籽粒饱满的橙色大白菜种子，无菌条件下，先用体积百分比为70％的酒精表面杀菌约1min，再用10％的NaClO溶液灭菌30～35min，然后用无菌水反复冲洗4～5次，最后将种子平放于MS基本培养基表面，在温度为25±1℃，光照时间16h/d，光照强度2000lx的条件下培养； 

2)当幼苗直立生长，两片子叶较大、半直立将展平、呈绿色，第一片真叶未露出(播种5～6d左右)时，在子叶柄基部和下胚轴交接处(即生长点)横切，后沿子叶柄纵切去除顶芽，并切除此子叶顶端的1/3的单片子叶为外植体； 

3)先将子叶段以子叶的下端竖直向下插入芽启动培养基中，培养2～3d，然后转入芽诱导培养基中培养10d，当不定芽长到2～3cm时，最后将诱导的不定芽转入生根培养基中培养。以上培养条件均为温度25±1℃，光照时间16h/d，光照强度2000lx； 

4)待幼苗基部形成大量的毛根后，炼苗4～5d，取出小植株，洗净根部培养基，移栽到珍珠岩∶草炭体积比为1∶3混合基质中，塑料薄膜保湿7 d，逐渐揭膜，10～15d即可入土栽培。 

所述的MS基本培养基由组成 

所述的芽启动培养基是在MS基本培养基中加入7.0mg.L^-16-BA和0.5mg.L^-1NAA； 

所述的芽诱导培养基是在MS基本培养基中加入5.5mg.L^-16-BA和0.5mg.L^-1NAA； 

所述的生根培养基是在1/2MS基本培养基中加入0.5mg.L^-1NAA。 

本发明以橙色大白菜子叶段为外植体，从苗态、切割方式和接种方式及添加6-BA与NAA两个激素组合几个方面，优化了橙色大白菜离体植株再生体系，为橙色大白菜转基因研究奠定基础。

本发明的橙色大白菜组织培养方法在传统橙色大白菜组织培养的基础上首次采用了芽启动培养基和对子叶段的不同切割方式，使的培养方法简单、易操作、成本低；同时，培养出来的不定芽质量好、健壮、没有畸形，提高了再生频率，缩短了再生周期，优化了橙色大白菜离体植株再生体系，为获得大白菜转基因的受体新材料提供了新的途径，对利用现代基因工程技术创新大白菜种质和新品种将具有重要的现实意义。 

附图说明