[发明专利]HBV病毒抗原及配体管式PCR检测试剂盒及其制备方法和应用

权利要求书

1、一种HBV病毒抗原及配体管式PCR检测试剂盒，包括

-PCR管为聚苯乙烯材料制成的普通PCR管，其上包被捕捉获得性人类免疫缺陷病HBV病毒靶分子的抗体或配基；

-检测试剂A液和B液，用于获得性人类免疫缺陷病HBV病毒配体/抗原检测；

-标准检测样品；

-阴性和阳性对照样品。

2、一种用于如权利要求1所述的HBV病毒抗原及配体管式PCR检测试剂盒的A液，其特征在于：它由100ul、pH值为7.4的25pmol/ul带有人为序列修饰的检测配基和2ug/ml抗体的磷酸盐缓冲液组成。

3、如权利要求2所述的一种用于HBV病毒抗原及配体管式PCR检测试剂盒的A液，其特征在于：所述人为序列修饰的检测配基是指人为在配基的3’和5’端分别或同时加上已知序列的单链茎环结构和两条互补双链。

4、一种用于如权利要求1所述的HBV病毒抗原及配体管式PCR检测试剂盒的B液，其特征在于：它由1ul上游引物、1ul下游引物、8ul 4×dNTP、10ul 10×PCR缓冲液、2～5单位的耐热DNA聚合酶和水组成；其中上游引物序列为1：5’-TCTAACGTGAATGATAG-3’；下游引物序列为2：5’-TATGGTCGAATAAGTTAA-3’。

5、如权利要求4所述的一种用于HBV病毒抗原及配体管式PCR检测试剂盒的B液，其特征在于：该B液还含有分子信标。

6、如权利要求5所述的一种用于HBV病毒抗原及配体管式PCR检测试剂盒的B液，其特征在于：所述的分子信标是修饰序列的茎环分子信标、SYBRGreen 1荧光染料及带有荧光分子和淬灭分子的探针分子信标中的任意一种。

7、一种制备如权利要求1所述的HBV病毒抗原及配体管式PCR检测试剂盒的方法，包括以下步骤：

(1)在37±1℃下、用体积浓度为1～20％的戊二醛处理PCR管，使戊二醛附着在PCR管；

(2)用超纯水清洗PCR管；

(3)将捕捉HBV靶分子的配基/抗体包被在PCR管上；

(4)用pH值为7.4的含5％的脱脂奶粉、甘氨酸、牛血清白蛋白和龟精DNA的碳酸氢钠缓冲液封闭PCR管，经干燥得PCR管；

(5)配制检测试剂A液：将检测HBV病毒的抗体和经序列修饰的抗体特异寡核苷酸配基在pH值为7.4的磷酸盐缓冲液中孵育并通过紫外线交联，或用磷酸盐缓冲液溶解配基即可；

(6)配制检测试剂B液：将B液各组分混合后加水即得；

(7)将干燥后的PCR管、检测试剂A液和B液与标准检测样品、阴性和阳性对照样品组装，放入试剂盒即可。

8、如权利要求7所述的制备HBV病毒抗原及配体管式PCR检测试剂盒的方法，其特征在于：所述步骤(3)中的配基包被在PCR管上是指先将链酶亲和素包被在PCR管上，再加入带有生物素的配体捕捉配基，通过链酶亲和素和生物素的结合，使捕捉配基固着在PCR管上。

9、如权利要求7所述的制备HBV病毒抗原及配体管式PCR检测试剂盒的方法，其特征在于：所述步骤(3)中的抗体包被在PCR管上是指将单克隆抗体用pH值为9.6的碳酸氢钠缓冲液包被在PCR管上。

10、一种如权利要求1所述的HBV病毒抗原及配体管式PCR检测试剂盒在检测获得性人类免疫缺陷病HBV病毒的特异寡核苷酸配体中的应用，包括以下步骤：

①设置阴性和和阳性标准曲线；

②待测样品的制备；

③在PCR管中加入待测样品和阴阳对照样品，在37±1℃孵育45～120分钟；

④将步骤③中孵育后的PCR管用洗液冲洗；

⑤在PCR管中加入A液，在37±1℃孵育45～120分钟；

⑥将步骤⑤中孵育后的PCR管用洗液冲洗；

⑦在PCR管中加入B液后再加入标准品，采用实时定量-PCR检测，并进行数据采集和处理。

11、如权利要求10所述的HBV病毒抗原及配体管式PCR检测试剂盒在检测获得性人类免疫缺陷病HBV病毒的特异寡核苷酸配体中的应用，其特征在于：所述步骤④和⑥中的洗液是指pH值为7.4、含0.05％吐温-20的磷酸盐缓冲液。

12、如权利要求10所述的HBV病毒抗原及配体管式PCR检测试剂盒在检测获得性人类免疫缺陷病HBV病毒的特异寡核苷酸配体中的应用，其特征在于：所述步骤⑦中的实时定量-PCR检测的标记物选自化学发光物质、酶、荧光和同位素中的一种或多种。