[发明专利]融合蛋白TT-B7-H4IgV及其制备方法和用途

权利要求书

1、一种融合蛋白TT-B7-H4IgV，其特征在于，所述的B7-H4IgV为B7-H4分子胞外区可变区IgV，TT为T辅助细胞表位肽或破伤风类毒素表位，在融合蛋白的N端还连接6个His残基，其连接方式为：6×His-TT-B7-H4IgV；其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2、一种融合蛋白TT-B7-H4IgV的重组核苷酸序列，其特征在于，其连接方式为：6×His序列-BamHI酶切位点-TT表位序列-EcorI酶切位点-B7-H4IgV重组序列-SalI酶切位点，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3、如权利要求2所述的融合蛋白TT-B7-H4IgV的重组核苷酸序列，其特征在于：构建于重组质粒pQE-30-TT-hB7-H4IgV，TT-hB7-H4IgV重组核苷酸序列通过BamHI、SaIl多克隆位点连接于质粒pQE-30中。

4、一种融合蛋白TT-B7-H4IgV的制备方法：其特征在于：

1)重组质粒pQE-30-TT-B7-H4IgV的构建

根据人B7-H4的cDNA基因序列，截取B7-H4胞外段IgV序列，上游引入BamHI酶切位点和T辅助细胞表位，T辅助细胞表位为破伤风类毒素表位TT830-843，其氨基酸序列为：Asn-Ser-Lys-Phe-Ile-Gly-Ile-Thr-Glu，下游引入SalI酶切位点，其重组序列如SEQ.ID.NO.2所示：

该重组序列中的4-12bp为linker序列，13-30bp为6个His编码序列，31-36bp为BamHI酶切位点，37-78bp为TT辅助表位肽编码基因序列，79-87bp为linker序列，88-93bp为EcorI酶切位点，94-326bp为B7-H4IgV区编码序列，327-333bp为SalI酶切位点；

通过BamHI和SalI多克隆位点将上述重组序列克隆入载体pBluescriptIISK-G；

将上述pBluescript II SK-G-TT-hB7-H4IgV载体转化大肠杆菌DH5α，提取质粒DNA后，将其与质粒pQE-30分别用BamHI和SalI进行双酶切，酶切产物用2.0％琼脂糖凝胶电泳分离，分别回收pBluescript II SK-G-TT-hB7-H4IgV获得的小片段333bp和pQE-30中的大片段，将回收后的小片段和大片段用T4连接酶在16℃连接过夜，转化DH5α感受态细胞，铺板、培养，挑取单克隆，提取质粒，经BamHI和SalI双酶切鉴定和DNA测序，获得含有B7-H4IgV融合基因原核克隆载体，重组质粒pQE-30-TT-B7-H4IgV构建成功；

2)重组质粒pQE-30-TT-B7-H4IgV的转化

感受态细胞的制备

取DH5α甘油菌种按1:100的体积比接种入LB培养液，在37℃振荡培养过夜，次日转接一次，继续培养至OD₆₀₀为0.4-0.6，无菌操作下将菌液冰浴10min，在离心为3000rpm×5min，温度为4℃下弃去上清液，加入沉淀物1/2体积预冷的100mmol/L的CaCl₂，吹起沉淀，冰浴40min，在离心为3000rpm×5min，温度为4℃下弃去上清液后加入沉淀物1/25体积的含质量浓度25％的甘油和100mmol/L的CaCl₂的混合溶液再次吹起沉淀，分装入Eppendorf管中，-70℃保存备用；

感受态细胞的转化、培养

将大肠杆菌感受态细胞从-70℃中取出，冰浴融解5-10分钟，加入含有重组质粒pQE-30-TT-hB7-H4IgV的悬液，轻微混匀，继续冰浴30分钟，然后铺板，LB固体培养基培养，37℃孵箱培养过夜；

3)重组蛋白的诱导表达、纯化

pQE-30-TT-B7-H4IgV工程菌的诱导表达

将含有pQE-30-TT-B7-H4IgV重组质粒的菌株接种于10ml含Amp的LB培养液中，于37℃培养过夜，次日按1％的体积比转接于10ml含Amp的LB培养液中，于37℃振荡培养至对数生长期A600nm＝0.4～0.6时，加入IPTG至终浓度为1mmol/L诱导表达，于37℃振荡培养3-5h，离心收集菌体，-20℃保存；

按5g菌体加50mL的PBS溶液的比例将重组质粒表达的菌体重悬，冰浴条件下进行超声裂菌；12000rpm离心15min，分别收集上清液和沉淀，将沉淀用4mol/L尿素洗涤，4℃条件下12000r/min离心20min；按1g沉淀加10mL的含0.1M的NaH₂PO₄、pH8.0的0.01M的Tris和8M的尿素的混合溶液，4℃搅拌2h，12000rpm离心15min，共离心2次，收集上清；

用Ni-NTA柱亲和层析纯化上清所溶解的目的蛋白沉淀，同样按1g沉淀加5ml的含8mol/L尿素、0.1mol/L的NaH₂PO₄和pH为8.0的0.01mol/L的Tris的混合溶液充分平衡Ni柱，采用含10mmol/L的咪唑、8mol/L的尿素、0.1mol/L的NaH₂PO₄和pH为8.0的0.01mol/L的Tris的混合液洗脱杂蛋白，再用含300mmol/L的咪唑、8mol/L的尿素、0.1mol/L的NaH₂PO₄和pH为8.0的0.01mol/L的Tris的混合液洗脱目的蛋白，收集目的蛋白所在的洗脱峰溶液；

将收集的目的蛋白洗脱峰溶液采用含4mol/L的尿素、0.1mol/L的NaH₂PO₄和0.01mol/L的Tris的混合溶液稀释10倍，装入透析袋，采用含2mmol/L的尿素、0.1mol/LNaH₂PO₄和pH为8.0的0.01mol/L的Tris的混合液透析，再采用pH为7.0的无菌水；透析袋内液和外液的体积比为1：10，收集透析袋中的液体，4℃条件下12000r/min离心20min，取上清冻干。

5、如权利要求1所述的融合蛋白TT-B7-H4IgV，其特征在于，该融合蛋白TT-B7-H4IgV应用于以B7-H4为靶点的抗肿瘤疫苗的制备。