[发明专利]聚乙二醇化重组人DesB30胰岛素及其制备方法和应用

说明书

技术领域  本发明涉及去B³⁰重组人胰岛素(重组人DesB30胰岛素)制备方法及采用化学修饰的方法使该胰岛素的合适部位结合聚乙二醇。具体涉及DesB30人胰岛素的P.Pastoris表达系统载体构建、重组质粒转化、发酵、纯化、酶切以及聚乙二醇化人DesB30胰岛素的制备方法。

背景技术  胰岛素是胰岛β细胞所分泌的一种激素，胰岛素通过与体内细胞膜上受体的相互作用，调节血糖维持在正常水平。Kjeldsen(Appl Microbiol Biotechnol，2000，54(3)：277～286)在S.cerevisiae中表达人胰岛素原时，最终不能有效地分泌胰岛素原或胰岛素，但若在在编码胰岛素原cDNA的分子中去除B³⁰苏氨酸(T)，并使之与S.cerevisiae的前导肽α因子相连，然后将人胰岛素原的C肽用短C肽代替或直接将B29赖氨酸(K)与A 1甘氨酸(G)相连，能有效提高单链胰岛素原类似物的分泌表达水平。Annibali(US Patent，7091032.2006-08-15)用巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)分泌表达出短C肽人胰岛素原B(1-30)-Y1-Y2-A(1-21)，其中Y1、Y2可以是赖氨酸(K)或精氨酸(R)。本发明选用P.pastoris作为基因表达系统，是因为与以往的基因表达系统相比，它具有高表达特性，被认为是最具有发展前景的生产蛋白质的工具之一。在P.pasoris中表达的蛋白既可存在于胞内，又可分泌至胞外。P.pasoris自身分泌的蛋白非常少，十分有利于纯化。分泌表达的短C肽人胰岛素原类似物的纯化和酶切的工艺相对简单，具有实际价值，本发明建立了仅用胰蛋白酶单一酶切除去短C肽AEDAK的方法和条件，建立的纯化工艺回收率高，为工业化制备和研究重组胰岛素具有重要意义

长效胰岛素的理想效果是通过尽可能少的胰岛素注射次数，在糖尿病患者体内重建胰岛素基础分泌。频繁地注射胰岛素，给糖尿病患者带来诸多的不便和痛苦，临床上需要注射间隔时间更长的超长效胰岛素。化学修饰是获得长效胰岛素的途径之一，经过化学修饰，可使胰岛素在保持生物活性的同时，半衰期延长，抗原性降低。化学修饰剂的结构必须稳定、无毒性、无抗原性并具有合适大小的分子量。诺沃挪第克公司(中国专利，200480021733.8，公开日：2006年9月6日)发明了一种新型胰岛素衍生物，该胰岛素衍生物是在母体胰岛素B链N-末端氨基酸残基的α-氨基处或者在母体胰岛素B链上存在的Lys残基的ε-氨基处连接了侧链的天然存在的胰岛素或其类似物，该胰岛素衍生物在生理pH值下可溶。聚乙二醇(PEG)是一种具有较好生物相容性的高分子化合物，对人体无毒性。用PEG活性酯修饰蛋白质或多肽药物，可在蛋白质或多肽分子上形成保护层，增大相对分子质量并增加药物的水溶性。相对分子质量的增大会降低肾小球的清除速率，增加药物在体内循环的半衰期，从而获得长效。耐科塔医药公司(中国专利，200710085552.7，公开日：2007年10月3日)发明了具有活性的亲水聚合物修饰的胰岛素衍生物。郁正艳等(中国专利，200410089050.8，公开日：2005年8月10日)发明了一种单甲氧基聚乙二醇-胰岛素复合物，胰岛素和单甲氧基聚乙二醇通过前者的游离氨基和后者的具有活性的丙醛基团连接在一起，分子量介于10.8～25.8KD。印春华等(中国专利，200610118923.2，公开日：2007年5月30日)发明了一种单修饰的聚乙二醇化胰岛素(PheB1-PEG-胰岛素)，聚乙二醇与胰岛素以碳氮键相连，分子量范围6.55～10.8KD。本发明选用单甲氧基聚乙二醇通过琥珀酰亚胺基活性基团与重组人DesB30胰岛素的Lys^B29或Lys^B29和Gly^A1的游离氨基形成酰氨键，制备而成的聚乙二醇化重组人DesB30胰岛素性质稳定，保留了胰岛素降血糖生物活性。经糖尿病动物模型证明本发明的聚乙二醇化重组人DesB30胰岛素可维持48-72小时的降血糖作用，可作为一种治疗I型和II型糖尿病的长效胰岛素药物。

发明内容

1、目的基因获得

选择DesB30人胰岛素(HIDesB30)的氨基酸序列，在A链与B链间加入短C肽(AEDAK)，形成DesB30人胰岛素原(HMPIDesB30)的氨基酸序列。根据酵母偏爱密码子，在5’端引入毕赤酵母表达载体的分泌信号肽α因子的Ste13识别位点和XhoI位点，3’端引入NotI位点和终止子，合成全基因。

2、毕赤酵母表达载体构建