[发明专利]载缓释抗菌肽组织工程骨及其制作方法

权利要求书

1、一种载缓释抗菌肽组织工程骨，其特征在于：所述载缓释抗菌肽组织工程骨由植骨材料载体和包裹有β-防御素-1～3或乳铁蛋白1-11的海藻酸缓释微球组成，所述包裹有β-防御素-1～3或乳铁蛋白1-11的海藻酸缓释微球附着在植骨材料微孔内；其中所述植骨材料为脱蛋白松质骨或脱钙松质骨。

2、根据权利要求1所述载缓释抗菌肽组织工程骨，其特征在于：所述包裹有β-防御素-1～3或乳铁蛋白1-11的海藻酸缓释微球粒径为230±60μm。

3、一种权利要求1所述载缓释抗菌肽组织工程骨的制作方法，其特征在于按如下步骤进行：

(1)选取脱蛋白松质骨或脱钙松质骨的植骨材料载体备用；

(2)制备含有β-防御素-1～3或乳铁蛋白1-11的海藻酸盐控释微球：采用乳化离子交联法制备，在35～38℃温度下配制1.1～1.8％的海藻酸钠溶液100ml，加入0.5～0.8mol/mlβ-防御素-1～3或乳铁蛋白1-11混合均匀；加入橄榄油11～14ml，加入1.2～1.7ml司盘-80和0.3～0.5ml吐温-80，混合均匀；1000～1500r/min搅拌5～7min，搅拌中滴入1.2～1.7mol/L氯化钙溶液10～15ml，形成水/油乳剂；然后改用磁力搅拌器慢速搅拌20～40min，交联固化；将乳剂转移至试管中，静置7～9h，取下层2000～2500r/min冷冻离心3～5min，分离微球，用蒸馏水洗涤3～5次，置-70～-75℃冰箱预冻4～5h，然后冷冻干燥机中冷冻干燥11～13h制得。

(3)将含有β-防御素-1～3或乳铁蛋白1-11的海藻酸盐控释微球与密度为1×10⁵～10⁶/ml的患者自身间充质干细胞悬液混匀，调海藻酸盐控释微球的浓度小于2.0g/L，将步骤1所述的蛋白松质骨或脱钙松质骨的植骨材料载体置入无菌抽滤瓶，滴加悬液至植骨材料载体上饱和后抽干空气，负压使海藻酸盐控释微球分布均匀，在35～38℃下含5～6％CO₂的孵箱内培养5～7天即得。

4、根据权利要求3所述载缓释抗菌肽组织工程骨的制作方法，其特征在于：所述步骤1脱蛋白松质骨的制备，在无菌条件下取自愿捐献遗体的成年人股骨远端松质部分，制成植入所需大小的骨块，采用与骨块质量比为1∶1的氯仿/甲醇液脱脂24～25h，50～60℃蒸馏水震荡冲洗，再用20～25％H₂O₂浸渍24～25h，反复3～5次，将处理后的骨块放入蒸馏水中于室温下浸泡透析24～25h，烘干制得。

5、根据权利要求3所述载缓释抗菌肽组织工程骨的制作方法，其特征在于：所述步骤1脱钙松质骨的制备，在无菌条件下取自愿捐献遗体的成年人股骨，剔除表面的骨膜、软组织和骨髓等，制成骨条，用双蒸水反复浸泡，至浸泡液澄清无血色、捞出、沥干，放入无菌的玻璃缸内，在25～30℃恒温摇床中，采用与骨块质量比为1∶1氯仿/甲醇浸泡8～9h，用36～38℃双蒸水反复冲洗3～5次，10～15min/次，再按每克骨块加入50～60ml浓度为0.6～0.8mol/L的盐酸脱钙，在室温下浸泡24～25h，每8～9小时更换盐酸1次，用浓度5～7％的碳酸氢钠溶液冲洗振摇，直至浸泡液呈中性再加入浓度为20～30％H₂O₂溶液中，密闭容器置36～38℃恒温箱中，浸泡72～74h，每12～14h更换溶液1次，每次换液前用36～38℃双蒸水反复冲洗3次，10～15min/次；用装有75～80％乙醇超声清洗机振荡清洗，每2～2.5小时更换洗涤液1次，连续洗涤3～5次，调pH为7.3±0.1后干燥制得。