[发明专利]一种抑制内毒素活性的小分子DNA适配子及其制备方法

说明书

(一)、技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是一种能抑制内毒素活性的小分子DNA适配子及其制备方法。

(二)、背景技术

脓毒症是严重创伤、休克、外科大手术后等常见的并发症，进一步发展可导致脓毒性休克、多器官功能障碍综合征等，已成为临床危重患者的重要死亡原因。至今仍无特殊的治疗措施，死亡率居高不下，是创伤外科及相关领域研究的难点和热点问题之一。研究表明：内毒素[Lipopolysaccharide，LPS]是引起G^-菌脓毒症及脓毒性休克的最主要原因之一，LPS及其引起的内毒素血症是G^-菌脓毒症、脓毒性休克发生的最主要诱因或始动因素。因此，抗内毒素治疗在脓毒症、脓毒性休克及LPS相关疾病的治疗中具有重要地位。至今仍无直接针对G^-菌的有效抗生素可用于治疗G^-菌脓毒症、脓毒性休克等疾病。以LPS本身为靶，通过拮抗并阻断内毒素作用的设想，已得到越来越多研究者的认同和关注，并取得一定进展。主要包括以下几个方面：(1)细菌内毒素合成抑制剂：通过阻断内毒素合成的关键限速酶等阻断LPS的合成，如2002年的BB78484及BB78485等显示了良好的运用前景；(2)阻断LPS与其受体结合：研究主要集中在LPS的结合蛋白及Lipid A(脂质A，LPS的核心结构)的结构类似物等，前者包括来自人体的和非人体的LPS结合蛋白，同时也包括经过改建的内毒素结合蛋白及其衍生肽类制剂和基因工程制剂。后者以Eisai(卫材)研究所报道的E5331为代表，显示良好的临床运用前景，目前已经进入临床I期，有望被FDA(美国食品药品监督管理局)批准。其次也包括抗内毒素抗体及疫苗：抗内毒素单抗已广泛用于实验室和大规模临床实验研究。还有报道的不同来源的LipidA的结构类似物诸如LipidA的前体一脂质X等也在进一步研究开发之中。(3)中和内毒素作用：主要以杀菌性/通透性增加蛋白(BPI)为代表，其中Rbpi21/23目前已被FDA批准进行扩大的III期临床实验，用于儿童脑膜炎及创伤后出血性休克的治疗。以LPS为靶点的策略，把握了脓毒症病理发生的关键环节，相应的制剂已取得一定效果，有的已经进入临床前期实验，显示良好的应用前景，但至今尚未运用于临床。同时，上述制剂在一定程度上也存在着不足：抗体的特异性决定了抗体仅能特异地与某种细菌的内毒素结合，对其他细菌内毒素无作用；抗体的异源性也限制其临床运用；结合蛋白的免疫原性与其半衰期短易降解和需长期反复用药之间又存在着矛盾；虽然有些制剂有较好的应用前景，但大多均经过计算机设计或化学合成，也不免存在着作用的特异性不高、拮抗效果不强等缺点。

系统进化指数富集技术(Systematic Evolution of Ligands byExponential Enrichment，SELEX技术)是20世纪90年代初研制的一种新的组合化学技术，其基本原理是运用一个大容量的随机寡核苷酸库，并结合PCR技术以指数级富集每一轮筛选到的与靶分子特异结合的寡核苷酸配基(aptamer)，经过几轮或十几轮筛选过程，获得高亲和力、高特异性的核酸配基。自发现以来，SELEX技术得到迅速的发展，在药物的快速开发、临床诊疗及生命进化等基础研究中均有广阔的运用前景。具有库容量大、靶分子范围广、亲和力高等优点，而且核酸药物与蛋白质、多肽药物相比，具有无免疫原性、组织渗透性强、体内不易降解和容易保存运输等优点。目前利用该技术已筛选到角细胞生长因子、血小板源性生长因子、血管内皮生长因子、碱性成纤维生长因子及其受体、凝血因子、HIV转录酶的抑制性DNA或RNA核酸配基，申请的专利达30多项，其中一种代号为NX1838的VEGF适配子已开始应用于临床试验以阻止病理性的血管生成，目前已被FDA批准用于眼科治疗。而且Internet还专门建立了SELEX数据库，汇集全球各实验室的筛选结果，资源共享，便于分析比较。