[发明专利]叶绿体型谷氨酰胺合成酶基因的植物表达载体及其构建和应用

权利要求书

1、一种重组植物表达载体，含有拟南芥叶绿体型谷胺酰胺合成酶基因即GS2基因。

2、权利要求1的重组载体，用于构建所述植物表达载体的起始载体为pK2GW7。

3、权利要求1的重组载体，其中GS2基因cDNA的上游添加有Rubi sco小亚基的光诱导型启动子PrbcS和叶绿体定位序列*T。

4、权利要求1的重组载体，为pK2-35S-PrbcS-*T-GS2，在起始载体pK2GW7上连有启动子PrbcS和叶绿体定位序列*T，其后紧接AMDH基因。

5、权利要求1的重组载体，由下述方法构建而成：

(1)从GenBank中查找拟南芥叶绿体型GS2的全长基因cDNA序列，并设计序列如下的一对引物：

GS25：5’-caccgcATGcCTCAGATCTTAGCAGCTTC-3’

GS23：5’-gaattcTTAAACATTCAAAGAAAGCTTTT-3’

5’端引物GS25，末端加caccgc特征序列，并将ATG后的G改为C由此形成SphI酶切位点；3’端引物GS23，末端添加EcoRI位点；以拟南芥第一链cDNA为模版扩增，得到GS2基因的全长cDNA；

(2)回收并纯化GS2全长基因cDNA片段，并将其连接到pMD18-T载体上，采用碱裂解法提取质粒DNA，通过PCR检测和酶切检测获得重组质粒pMD-GS2；

(3)构建入门载体pENTR*-PRbcS-*T-GS2，用SphI以及EcoRI切割pENTR*-PrbcS-*T-GFP(pENTR*-PrbcS-*T-GFP的构建见本申请人的另一项专利申请，申请号为200710066422.9)和pMD-GS2，回收载体pENTR*-PrbcS-*T片段和GS2基因片段，然后连接、转化、抽提质粒进行PCR检测和酶切检测，获得重组质粒pENTR*-PrbcS-*T-GS2。

(4)构建植物表达载体pK2-35S-PrbcS-*T-GS2，通过Gateway技术的LR反应把PrbcS-*T-GS2亚克隆到植物表达载体pK2GW7中，获得GS2基因的植物表达载体pK2-35S-PrbcS-*T-GS2。

6 权利要求1谷胺酰胺合成酶基因GS2的cDNA来源于拟南芥，来源于拟南芥的叶绿体型谷胺酰胺合成酶基因GS2的cDNA GenBank登录号为S69727。

7、权利要求1所述的重组植物表达载体的构建方法，其特征在于：

(1)从GenBank中查找拟南芥叶绿体型GS2的全长基因cDNA序列，并设计序列如下的一对引物：

GS25：5’-caccgcATGcCTCAGATCTTAGCAGCTTC-3’

GS23：5’-gaattcTTAAACATTCAAAGAAAGCTTTT-3’

5’端引物GS25，末端加caccgc特征序列，并将ATG后的G改为C由此形成SphI酶切位点；3’端引物GS23，末端添加EcoRI位点；以拟南芥第一链cDNA为模版扩增，得到GS2基因的全长cDNA；

(2)回收并纯化GS2的全长基因cDNA片段，并将其连接到pMD18-T载体上，采用碱裂解法提取质粒DNA，通过PCR检测和酶切检测获得重组质粒pMD-GS2；

(3)构建入门载体pENTR*-PRbcS-*T-GS2，用SphI以及EcoRI切割pENTR*-PrbcS-*T-GFP(pENTR*-PrbcS-*T-GFP的构建见本申请人的另一项专利申请，申请号为200710066422.9)和pMD-GS2，回收载体pENTR*-PrbcS-*T片段和GS2基因片段，然后连接、转化、抽提质粒进行PCR检测和酶切检测，获得重组质粒pENTR*-PrbcS-*T-GS2；

(4)构建植物表达载体pK2-35S-PrbcS-*T-GS2，通过Gateway技术的LR反应把PrbcS-*T-GS2亚克隆到植物表达载体pK2GW7中，获得GS2基因的植物表达载体pK2-35S-PrbcS-*T-GS2。

8、权利要求1-5之一的重组植物载体在制备农杆菌转基因植株中的应用。

9、权利要求1-5之一的重组植物载体在制备农杆菌转基因烟草中的应用。