[发明专利]以树鼩CD81基因构建的质粒为标准品的Taqman探针荧光定量PCR方法无效
| 申请号： | 200810233735.3 | 申请日： | 2008-12-22 |
| 公开（公告）号： | CN101691602A | 公开（公告）日： | 2010-04-07 |
| 发明（设计）人： | 夏雪山;冯悦;赵文华;刘丽;魏大巧 | 申请（专利权）人： | 昆明理工大学 |
| 主分类号： | C12Q1/68 | 分类号： | C12Q1/68 |
| 代理公司： | 昆明今威专利代理有限公司 53115 | 代理人： | 赛晓刚 |
| 地址： | 650093 云南省昆明*** | 国省代码： | 云南;53 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | cd81 基因 构建 质粒 标准 taqman 探针 荧光 定量 pcr 方法 | ||
1.一种以树鼩CD81基因构建的质粒为标准品的Taqman探针荧光定量PCR方法，包括 对树鼩CD81基因片段的克隆并测序，通过T-A克隆技术构建了PMD-18T-CD81质粒，以克 隆的树鼩CD81基因片段为目标，设计Taqman PCR引物和探针，设计实验找到最优条件下 引物的退火温度、引物浓度、探针浓度，提纯该质粒并计算CD81基因片段拷贝数，以计算 好的质粒用10倍梯度稀释，配制拷贝数为103～107copies阳性质粒建立标准曲线，用该检测 体系对HCV体外感染的树鼩原代肝细胞样品CD81的变化情况进行检测；其特征在于：
(1)PCR引物为两条CD81寡聚核苷酸引物F/R：
F：5’-ATGGGAGTGGAGGGCTGCACCAA-3’
R：5’-TCAGTACACGGAGCTGTTCCGGATG-3’
(2)以树鼩肝脏中提取的RNA为模板，获得树鼩CD81cDNA片段，将该片段纯化并测 序；
(3)该片段纯化后，通过T-A克隆连接到PMD-18T质粒中，然后转化至大肠杆菌感受 态细胞JM-109中进行扩增；筛选阳性克隆子提取克隆子并进行纯化，获得树鼩CD81分子测 定的外参照阳性质粒；
CD81寡聚核苷酸引物和探针为：
CD81FP：5’-GGAGGACTGCCACCAGAAGAT-3’
CD81RP：5‘-CAGCACCATGCTCAGGATCA-3’
CD81Probe：5‘(FAM)-AAGCTGTACCTCATCGGCATCGCG-(TAMRA)3’；
(1)检测体系退火温度的确定，
(2)检测体系探针浓度和引物浓度的确定，
(3)配置103～107拷贝数的CD81质粒，以此为模板建立了该检测体系的标准曲线，
(4)在批间、批内、组间、组内四个层次验证该方法体系的重复性和稳定性，
(5)利用确定浓度的CD81质粒分别10倍梯度稀释107、106、105、104、103、102、101、 100copies，得到动力学曲线，检测该检测体系的灵敏性；对不同HCV感染剂量的树鼩原代肝 细胞中CD81基因进行的检测不同感染剂量后的细胞中CD81的拷贝数的确定。
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