[发明专利]甘蔗白条病菌检测方法

说明书

技术领域：

本发明涉及植物保护领域，尤其是一种甘蔗白条病菌检测方法。

背景技术：

甘蔗白条病是由细菌白条黄单胞(Xanthanonas albilineans)引致的世界性甘蔗重要病害，广泛分布于美国、加拿大等多个国家和地区。该病害主要通过带菌种茎进行远距离传播，是国内外重要的检疫对象

目前，甘蔗白条病的检测方法主要有选择性培养基分离鉴定法、酶联免疫吸附测定法、酶免疫分析法、组织印迹法等。但是，这些方法在检测时间、灵敏度、稳定性等方面存在不足，且检测特异性不强。

发明内容：

本发明提出一种甘蔗白条病菌的检测方法，该方法能有效提高甘蔗白条病菌的快速检测，使检测更准确、灵敏、特异性更强。

本发明包括以下步骤：

1、分别采用打气泵吹汁法和高速离心法提取甘蔗汁液和甘蔗白条病菌检测样本中的模板DNA；

2、利用甘蔗白条病菌的特异性引物进行聚合酶链式反应PCR；

3、用琼脂糖凝胶电泳扩增检测反应产物，出现目标电泳条带即可确定检测样本中有甘蔗白条病菌存在，所说的目标电泳条带是指600bp(碱基对)扩增带。

本发明提供的甘蔗白条病菌检测方法，为甘蔗品种/材料交换病害的检测提供了技术关键，可有效防止该病害随引进的甘蔗品种/材料传播蔓延，对甘蔗生产造成严重威胁；完善了甘蔗白条病菌PCR检测方法，聚合酶链式反应PCR检测方法克服了选择性培养基分离鉴定法、酶联免疫吸附测定法、酶免疫分析法或组织印迹法等现有检测方法花费时间长，灵敏度、稳定性较差，检测特异性不强等不足，大大提高了检测效率和检测的准确性。

附图说明

图1是本发明的实施例中不同甘蔗样品PCR检测结果拍照示意图。

具体实施方式：

具体步骤如下：

1、提取甘蔗汁液：每个待测甘蔗样本取5～6条蔗茎，每条蔗茎截取中下部茎节，用砍刀切成12～18cm左右长，每取一个样品后均用70％的酒精消毒砍刀，再用打气泵吹1.5～2.5ml左右的甘蔗汁于离心管内，置于冰上，带回室内放于-18～20℃冰箱保存备用；

2、提取检测模板DNA：

取保存的甘蔗汁液解冻，置于离心机上，转速为13000rpm/min离心3min，弃清液；于离心沉淀物中加1000μL灭菌水，置于离心机上，转速为13000rpm/min离心3min，弃清液；于离心沉淀中加1000μL灭菌水，置于离心机上，转速为13000rpm/min离心3min，弃上清；加20-200μL灭菌水，于-18～20℃保存备用；

3、用甘蔗白条病菌的特异性引物进行聚合酶链式反应PCR：

1)特异性引物序列：Forward primer XAF：5’CCTGGTGATGACGCTGGGTT，Reverse primer XAR：5’CGATCAGCGATGCACGCAGT；

2)反应体系：2.5μL 10×缓冲液(buffer)，2.0μL 25mM氯化镁(MgCL₂)，0.5μL XAF(20μM)，0.5μL XAR(20μM)，1.0μL 10mM三磷酸脱氧核糖核苷酸混合液(dNTPs)，0.2μL Taq聚合酶(5.0U/μL)，1.0μL模板(DNA)，17.3μL灭菌水(H₂O)，总体积为25μL；

3)反应参数：PCR反应参数为95℃ 5min；94℃ 45sec，65℃ 1min，72℃1min(1^st10 cycles)，2min(2^nd10 cycles)，3min(3^rd10 cycles)，30个循环；72℃ 10min。

4、反应产物电泳检测：

用1％琼脂糖凝胶电泳对反应产物进行扩增检测，并用凝胶成像分析系统观察拍照电泳扩增结果。

实施例：国外甘蔗品种白条病的PCR检测

1、材料

从法国引进的甘蔗品种/材料：ISD28、CP92-1641、CP94-1100、KZ9424、SP803280、SP813250、VMC9509、VMC9588和VMC95105，每个待测甘蔗样本取5～6条蔗茎，每条蔗茎截取中下部茎节，用砍刀切成15cm左右长，每取一个样品后均用70％的酒精消毒砍刀，再用打气泵吹2ml左右的甘蔗汁于离心管内，置于冰上，带回室内放于-18℃冰箱保存备用。

2、提取检测模板DNA