[发明专利]猪源大肠杆菌中抗链霉素基因strB的PCR检测方法

说明书

技术领域：

本发明涉及一种猪源大肠杆菌中抗链霉素基因strB的PCR检测方法，属检测技术领域。

背景技术：

长期以来抗菌剂(包括抗生素，硫酸铜等)被作为生长促进剂添加到饲料中，在增加动物养殖效益的同时导致高频率的抗生素抗性细菌的出现，这些抗性细菌携带的抗性基因可以被转移到在人类致病菌，这是对人类健康的潜在威胁。Aarestrup等推测禁止使用抗生素作为生长促进剂添加到猪饲料中后，在养猪场抗生素抗性细菌仍然保持高发生率的原因可能是由于铜仍然被添加到猪饲料中作为生长促进剂，它们选择抗生素抗性细菌并维持了它们的发生率(Aarestrup，F.M.，H.Hasman，L.B.Jensen，et al.2002.Antimicrobial resistance among enterococcifrom pigs in three European countries.Appl.Environ.Microbiol.68：4127-4129.)。链霉素抗性基因strA和strB广泛存在与人体、动物体、和植物体的正常菌群和病原菌中(Sundin，G.W.，Monks，D.E.&Bender，C.L.Distribution of thestreptomycin-resistance transposon Tn5393 among phylloplane and soil bacteria frommanaged agricultural habitats.Can J Microbiol 41，792-799.)，四环素抗性基因tet(B)也是一个在革兰氏阴性细菌中常见的抗性基因(Roberts，M.C.Update on acquiredtetracycline resistance genes.FEMS Microbiol Lett 245，195-203.)。这三个基因常被作为抗生素抗性基因的代表来进行检测。

目前我国的猪饲养业仍然在饲料中添加抗生素和铜盐、锌盐作为生长促进剂，这必然对猪肉产品安全造成威胁。快速检测猪源大肠杆菌中是否存在抗性基因对评价猪肉产品安全具有重要意义。而常规PCR检测程序需要从细胞中提取DNA样品，耗时长，试剂消耗多，造成检测样品周期长成本高。本发明采用猪源大肠杆菌单菌落直接做DNA模板，实现了用PCR方法快速、经济地检测猪源大肠杆菌中的抗链霉素基因strB。

经文献检索，未见与本发明相同的公开报道。

发明内容：

本发明的目的在于克服现有检测方法之不足，而提供一种猪源大肠杆菌中抗链霉素基因strB的PCR检测方法。

本发明的检测方法包括：用于PCR检测的猪源大肠杆菌单菌落培养物的制备；抗链霉素基因strB的引物序列；PCR反应液组成；PCR扩增反应条件；PCR扩增产物的检测方法。

其中，用于PCR检测的猪源大肠杆菌单菌落培养物的制备方法：将分离到的待检测的猪源大肠杆菌菌株划线接种在牛肉膏蛋白胨培养基平板上，37℃培养18-36h，得到单菌落。

抗链霉素基因strB的引物序列为：上游：5’GACTCCTGCAATCGTCAAGG 3’；下游：5’GCAATGCGTCTAGGATCGAG 3’；PCR扩增产物大小为：560bp。

PCR反应液组成：10x PCR buffer，10μM上游引物序，10μM下游引物序，(3)10μM dNTP，用一个无菌的0.5-10μL移液枪头挑取一个单菌落(作为DNA模板)放入PCR反应液中混匀，1.5-3.0U Taq酶，反应体系20-50μL。

PCR扩增反应条件：94℃预变性5-10min；94℃变性1min、55℃退火1min、72℃延伸2min、共进行30-35个循环；72℃延伸10min，于4℃下保存。

PCR扩增产物的检测方法：将扩增产物于0.8-2.0g/L的琼脂糖凝胶电泳检测及UV I凝胶成像分析结果。

本发明与现有技术相比，具有较好的特异性，能在5h内完成对猪源大肠杆菌样品是否带有抗铜基因pcoA的检测，检测方法快速、简便、且经济。本发明为评价猪肉食品安全提供了一个技术手段，有良好的运用前景。

附图说明：

图1为本发明方法检测健康猪源抗铜大肠杆菌菌株中抗链霉素基因strB的电泳图，其中：

M：分子量标准

1：抗铜大肠杆菌菌株W2a6

2：抗铜大肠杆菌菌株W2a51

3：抗铜大肠杆菌菌株W1c4

4：抗铜大肠杆菌菌株W1c12