[发明专利]TaqMan-PCR对副溶血性弧菌和沙门菌的检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种TaqMan-PCR对副溶血性弧菌和沙门菌的检测方法

背景技术

沙门菌和副溶血性弧菌是常见的重要食源性致病菌，通过污染的动物源性食品感染人类，导致食物中毒危害人体健康。针对这2种致病菌的检验，GB/T4789标准和ws行业标准都需要3～5天时间，远远不能食物中毒应急检测的需要。本研究旨在建立一种快速、准确、特异、灵敏、经济的沙门菌和副溶血性弧菌双重荧光PCR检测方法，以应用于食物中毒的快速检验，有效地解决传统分离鉴定法中存在的费时、费力等问题及其他快速检测方法中存在的试剂成本高的问题

发明内容

本发明提供了一种TaqMan-PCR对副溶血性弧菌和沙门菌的检测方法，它简便、快速、成本低，能适应沙门氏菌和副溶血性弧菌的检测。

本发明采用了以下技术方案：一种TaqMan-PCR对副溶血性弧菌和沙门菌的检测方法，它包括以下步骤：一，TaqMan荧光定量检测副溶血性弧菌和沙门菌方法的建立；首先选择实验菌种，菌株：沙门菌21株，副溶血性弧菌26株，大肠杆菌3株，李斯特菌1株，霍乱弧菌1株，创伤弧菌、志贺氏菌、变形杆菌和假单胞菌各1株、溶藻弧菌、表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌和蜡状芽孢杆菌各1株，共58株标准菌株和参考菌株；二，门菌荧光PCR的引物设计选取沙门菌侵袭蛋白A(invA)，根据Genbank公布的invA序列20条，使用Dnaman软件对这20条序列进行比对，选出一段保守序列，使用primer express软件进行引物和探针设计，设计出的引物和探针由大连宝生物公司合成，副溶血性弧菌荧光PCR的引物设计选取副溶血TLH(invA)。根据Genbank公布的TLH序列各个国家各个时期20条，使用Dnaman软件对这20条序列进行比对，选出一段保守序列，使用primer express软件进行引物和探针设计，设计出的引物和探针由大连宝生物公司合成。引物使用前12000rpm离心1分钟后，小心打开盖子，使用DEPC处理的蒸馏水进行稀释，稀释浓度为20Pmol毫升。稀释后涡旋1分钟，3000转离心30s后，-20℃储存备用，

三，Real-time PCR反应体系的建立

PCR反应体系采用大连宝生物公司的荧光PCR检测试剂盒，由于试剂盒中的MgCl2浓度和荧光信号检测温度都以做过优化，本研究将不做优化，引物浓度的优化采用矩阵法，引物体积优化范围在0.3-1.0μl，探针的优化范围也在0.3-1.0μl。体系将装有PCR缓冲液、UNG酶及探针的离心管从-20℃中取出，置于冰盒上待其缓慢融化后，短暂离心，将探针及PCR缓冲液全部加入UNG酶管中配制成PCR反应液，混匀，短暂离心，置于冰盒上备用，使用后剩余PCR反应液可放入-20℃冰箱中保存，配制PCR反应液，PCR反应条件：95℃10秒；95℃5秒，60℃30秒，40个循环。

四，对粪便样品进行处理，

五，对核酸进行；

六，进行DNA灵敏性分析，DNA灵敏度分析：按常规DNA提取方法提取模板DNA。用Bio-rad紫外可见光蛋白核酸分析仪测DNA的浓度。然后进行10倍稀释，每个稀释度取2ul用于实时PCR反应，根据检测的最低值检测出最低DNA浓度；

七，特异性分析：将各种沙门氏菌属菌株和非沙门氏菌属菌株用TSB增菌液过夜增菌，取1mL增菌液提取DNA，取2μl作为模板，用建立的荧光PCR方法进行检测，以是否出现Ct值为判断阳性或阴性的标准。副溶血型弧菌特异性检测方法同沙门菌一致。PCR反应条件：95℃10秒；(95℃5秒，60℃30秒，40个循环)。

八，多重Real-time PCR方法的建立：使用矩阵法优化得出最佳引物浓度进行双重荧光PCR方法的建立，将副溶血弧菌和沙门菌引物和探针放入一个管子中进行扩增，对反应结果反应体积为25μl，。反应程序为：95℃3min变性后，以94℃15s、58℃45s进行45个循环。于58℃检测FAM、VIC通道的荧光信号。

九，进行PCR结果判断：1，Ct≤37的样品，按照参比曲线计算浓度报告；2，37≤Ct＜40的样品，可能因为标本滴度较低而造成漏检，故建议重复测定一次结果仍在此范围则定为阴性，反之按照参比曲线计算浓度报告；3，.当Ct＝40或Ct＝0时，报告为阴性；