[发明专利]水稻高亲和硝酸盐运输蛋白基因OsNAR2.1

说明书

技术领域

本发明公开了水稻高亲和硝酸盐运输蛋白基因OsNAR2.1序列及其应用，属于基因工程领域，具体地讲该基因的应用显著促进了水稻对硝酸盐的吸收。

背景技术

氮素是作物重要的大量营养元素之一，参与生物体各种代谢过程。它是植物体中很多生命物质的组成成分，比如：氨基酸、蛋白质、核酸、酶、叶绿素等。氮分别占植物体干重的1.5—2％和植物总蛋白的16％(Frink CR.，Waggoner PE.and Ausubel JH.Nitrogen fertilizer：retrospect andprospect.Proc.Natl Acad.Sci.USA.1999.96：1175-1180.)。

目前，中国氮肥用量占全球氮肥用量的30％(彭少兵，黄见良，钟旭华，杨建昌，王光火，邹应斌，张福锁，朱庆森，Roland Buresh，Christian Witt.提高中国稻田氮肥利用率的研究策略.中国农业科学.2002，35(9)：1095～1103)，成为世界第一大消费国。其中水稻田中氮肥的施用量超过其它任何农作物，氮肥的损失量占施肥总量的70％。我国普遍存在着由于氮肥利用率低和大量的氮素损失导致的一系列环境问题。水稻虽然是喜铵作物，但是已经有研究表明一定量的硝态氮能够促进水稻对铵的吸收，而且在水稻生长发育的后期田里和旱作水稻主要以硝态氮为主。因此高亲和硝酸盐运输蛋白OsNAR2.1能够显著促进水稻对硝酸盐吸收，从而提高水稻对氮肥的利用率、增加水稻的产量。

发明内容：

技术问题：

本发明的目的提供水稻高亲和硝酸盐运输蛋白基因OsNAR2.1的序列及其应用，该基因可作为目的基因在水稻中过量表达，可提高水稻在低硝态氮条件下对硝态氮的吸收以及氮素利用效率甚至可以提高水稻产量。

技术方案：

本发明提供了水稻高亲和硝酸盐运输蛋白基因OsNAR2.1，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1，共621bp。该基因表达产物为水稻高亲和硝酸盐运输蛋白OsNAR2.1，其氨基酸序列为SEQ ID NO.2，共206个氨基酸。OsNAR2.1的基因工程可以在提高作物氮肥利用效率以及产量方面应用。

有益效果：

1、本发明人公开水稻高亲和硝酸盐运输蛋白基因OsNAR2.1序列及其所编码的蛋白质。mRNA表达分析表明OsNAR2.1基因主要在水稻根部表达，而且在0.2mM硝态氮的诱导下强烈表达。

2、本发明人首次公开了高亲和硝酸盐运输蛋白OsNAR2.1的功能，其功能是显著促进了OsNRT2.1(AB008519)蛋白、OsNRT2.2(AK109733)蛋白(OsNRT2.1和OsNRT2.2基因虽然cDNA序列有所差异，但是其开放读码框的序列完全一致，所以它们的蛋白产物是一个产物)以及OsNRT2.3a(AK109776)蛋白对硝酸盐的吸收，有望应用于水稻的遗传改良。

3、本发明人首次得到超表达水稻高亲和硝酸盐运输基因OsNAR2.1的转基因植株，并且表现出显著提高氮素利用效率以及水稻产量15％。

附图说明

图1：蛙卵异源表达系统的载体—pT7Ts图谱

图2：蛙卵异源表达OsNAR2.1蛋白，表明该蛋白促进OsNRT2.1(或OsNRT2.2)蛋白对硝酸盐吸收

图3：蛙卵异源表达OsNAR2.1蛋白，表明该蛋白促进OsNRT2.3a蛋白对硝酸盐吸收

图4：OsNAR2.1在水稻不同部位(叶片，茎秆，侧根区，根尖区)表达特征

1：根尖区(3-4cm)；2：侧根区；3：茎秆；4：叶片

图5：OsNAR2.1在不同氮素形态下的表达特征

1：0.2mM硝酸盐；2：0.2mM铵

图6：OsNAR2.1与OsNRT2基因在RNAi突变体株系1和2与野生型(WT)的表达

图7：在不施氮肥条件下超表达OsNAR2.1基因应用与对照野生型水稻结实率差异

具体实施方案

一、水稻高亲和硝酸盐运输蛋白基因OsNAR2.1序列的克隆

1)总RNA的提取  水稻(日本晴)幼苗长至3叶期，用0.2mM硝态氮进行处理6小时后立即取根迅速置于液氮中冷冻保存，称取0.1g左右根，用液氮研碎，研磨充分加入1.5ml离心管，迅速加入1ml Trizol试剂(购自Invitrogen，USA)，充分摇匀振荡后，抽提总RNA。

2)OsNAR2.1基因全长的克隆