[发明专利]一种高温α-淀粉酶及其突变体的高效制备方法

说明书

技术领域

本发明为使用芽孢杆菌宿主细胞对具有淀粉水解活性的高温α-淀粉酶及其突变体进行高效制备的方法。本发明中的具有淀粉水解活性的高温α-淀粉酶来源于地衣芽孢杆菌菌株，高温α-淀粉酶突变体来源于地衣芽孢杆菌菌株的α-淀粉酶人工突变体。进一步，本发明使用特定表达载体在芽孢杆菌，特别是地衣芽孢杆菌宿主细胞中，对高温α-淀粉酶及其突变体进行高效分泌表达与制备。本发明属发酵工程领域。

背景技术

淀粉是由葡萄糖聚合形成的一类高分子物质。淀粉由直链淀粉和支链淀粉两部分组成。淀粉粒一般为圆形或不规则形，大小为1-100μm，以内部氢键维持其结构。淀粉颗粒内部为复杂的结晶组织，由于水分损失等原因位于颗粒表面的成分形成一种结构紧密的外膜，对外力具有较强的抵抗力。因此，淀粉颗粒不溶于水和有机溶剂。淀粉是工业上制取葡萄糖和糊精的主要原料。传统的方法用酸将淀粉水解成小分子的糊精和葡萄糖，这种方法目前已被α-淀粉酶和糖化酶组成的酶法水解工艺所取代。

淀粉作为原料在工业中的应用，其最主要的方式是将淀粉水解成葡萄糖、麦芽糖或者寡糖糖浆。这些糖浆随后被用作原料用于如酒精、有机酸、氨基酸等工业生产或直接作为产品用于其他工业领域。淀粉水解工艺过程常常包括以下两个步骤：液化和糖化。在淀粉液化过程中，淀粉颗粒在冷水中形成乳浊液，在加热到60～70℃后，淀粉颗粒吸水膨胀，体积迅速增加，晶体结构被破坏，颗粒外膜裂开，形成一种糊状的粘稠液体(这一过程称为糊化)。浓度较高的淀粉液糊化时，必须迅速液化，否则淀粉液的粘度急剧上升会使设备无法运行，另外已经糊化的淀粉在温度降低后会发生老化而无法液化。因此，用于淀粉液化的α-淀粉酶，必须至少能耐受淀粉糊化所需温度。淀粉糊化后，分子链直接暴露在酶分子的作用之下，分子链被迅速切断，变短，最终形成低分子量的糊精，液体粘度急剧下降，这一过程被称为液化。现行大规模工业化淀粉水解工艺中的主流工艺为瞬间高温喷射液化，液化时淀粉醪的内部温度达到105℃以上。此外，目前绝大多数以淀粉为原料的制糖和发酵工艺中皆采用废液回流策略，淀粉醪的pH值会因此降至5.0以下。因此，在高温和酸性条件下具有高活性的α-淀粉酶对淀粉液化工艺的优化和简化具有极其重要的价值。

目前，高温α-淀粉酶主要来源于地衣芽孢杆菌菌株。1972年，地衣芽孢杆菌已被大规模应用于淀粉酶的发酵生产，1981年，《食品化学品索引》(FoodChemicals Codex)将地衣芽孢杆菌列为食品加工用淀粉酶和蛋白酶的来源。1981年，由地衣芽孢杆菌生产的淀粉水解酶和蛋白酶被美国FDA鉴定为GRAS级。可见，地衣芽孢杆菌是生产高温α-淀粉酶的、安全性能良好的生产菌株。

获得酸性高温α-淀粉酶的方式概括起来有两种。一种是在原有地衣芽孢杆菌高温α-淀粉酶的基础上，通过自然筛选、基因克隆、蛋白质工程等有关手段对蛋白质分子进行改造，以此获得耐高温、耐酸性性能提高的高温α-淀粉酶突变体(Lee et al.J Biochem，2006；Declerck et al.Protein Eng，2003；Andrew et al.Curr Opin Biotechnol，1999)；另一种是从自然界中寻找高温酸性α-淀粉酶新型分子(Jorgenson et al，Appl Environ Microbiol，1997；Richardson et al.J Biol Chem，2003)，如Pyrococcus sp.的α-淀粉酶，但产酶水平不到2U/mL。

无论是通过哪一种方式，所获得的在高温酸性条件下具有高活性的α-淀粉酶分子，必须经过高效和廉价制备，才会具有工业应用意义。进一步，地衣芽孢杆菌高温α-淀粉酶(Bacillus licheniformis α-amylase，BLA)在工业应用中使用多年，如果能够实现BLA及其突变体的高效和廉价制备，则一方面可以进一步降低其生产成本，为多种工业应用用途提供廉价的不同适宜性能的高温α-淀粉酶；另一方面也可以提高相关应用工艺技术的完善与优化，简化如燃料酒精工业生产时制糖过程的酸碱度调节工艺。

与其它几乎所有发酵工业相似，实现高温α-淀粉酶的高效和廉价制备主要依赖：1)优良生产菌株的选育；2)优秀的发酵工艺技术。