[发明专利]氨基酸诊断/测定试剂(盒)及氨基酸的浓度测定方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种氨基酸诊断/测定试剂(盒)，同时本发明还涉及测定氨基酸浓度的方法，属于医学/食品/环境检验测定技术领域。

背景技术

氨基酸含量的测定在医学/食品/工业/农业/环境中都是比较重要的测定项目。现有的测定方法有色谱法、电化学法、仪器分析法(氨基酸分析仪)、分光光度计等方法，这些方法或是操作方法较为繁杂、特异性差、或仪器设备成本较高等缺点。

氨基酸不是单纯的一种物质，用氨基酸分析仪可直接测定出17种氨基酸(仪器价格昂贵，不能普遍使用)，对于医学/食品/工业/农业/环境中来说，多数情况下，都是很多种氨基酸同时存在，所以需要测定总的氨基酸含量，它们不能以氨基酸百分率来表示，只能以氨基酸中所含的氮(氨基酸氮)的百分率表示。

大量食肉或饥饿时尿中氨基酸氮增加，孕妇及新生儿尿液氨基酸氮也增加。氨基酸代谢异常，造成某些氨基酸在体内积累过多，使尿中氨基酸氮增高；急性肝萎缩、肝功能衰竭、Reye综合征、或某些因素造成蛋白质分解加速的疾病，遗传性疾病所导致的代谢异常均可使尿中氨基酸氮增加。

酶法测定血、尿、体液、食品、土壤、工业产品中氨基酸氮含量具有特异性高、方法简便、成本低的特点。

发明内容

本发明要解决的技术问题是：提出一种利用酶比色法(EnzymaticColorimetric Method)及酶(偶)联法(Couple Reaction)技术，计量还原型烟酰胺辅酶(还原型辅酶)在340nm波长处吸光度的变化，得以测定氨基酸浓度的方法，同时，本发明还将给出用以实现该方法的氨基酸诊断/测定试剂(盒)，采用该试剂不仅可以在紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪上进行氨基酸浓度测定，而且测定速度快、准确度高，因而可以得到切实的推广应用。

本发明氨基酸浓度测定方法如下：

氨基酸+水+氧  氨基酸氧化酶  氧代酸+氨+过氧化氢

过氧化氢+谷胱甘肽二硫  谷胱甘肽氧化酶  2谷胱甘肽+氧

谷胱甘肽+甲醛+辅酶  甲醛脱氢酶  甲酰基谷胱甘肽+

                                        还原型辅酶

这种方法应用氨基酸氧化酶(amino-acid oxidase；EC 1.4.3.2；EC 1.4.3.3)酶(偶)联谷胱甘肽氧化酶(glutathione oxidase  EC 1.8.3.3)、甲醛脱氢酶(formaldehyde dehydrogenase；EC 1.2.1.1)酶促反应比色终点法。氨基酸氧化酶酶解氨基酸反应产生过氧化氢，再通过(偶)联合谷胱甘肽氧化酶、甲醛脱氢酶的作用，最终将辅酶(在340nm处没有吸收峰)还原成为还原型辅酶(在340nm处有吸收峰)，从而得以测定还原型辅酶在340nm处吸光度上升的程度，通过测量340nm处吸光度上升的程度，可以测算氨基酸的浓度大小。

实验表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考虑，无论是单剂、双剂还是三剂，如下成分关系的本发明氨基酸诊断/测定试剂(盒)较为理想：

缓冲液    100mmol/L

稳定剂    500mmol/L

辅酶      3mmol/L

氨基酸氧化酶      10000U/L

谷胱甘肽氧化酶    12000U/L

甲醛脱氢酶        12000U/L

谷胱甘肽二硫      7mmol/L

甲醛              15mmol/L

本发明的氨基酸诊断/测定试剂(盒)可以是单剂，包括：

缓冲液、稳定剂、辅酶、氨基酸氧化酶、谷胱甘肽氧化酶、甲醛脱氢酶、谷胱甘肽二硫、甲醛。

试剂(盒)可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。

也可以将上述单剂试剂配成如下双剂试剂：

试剂1

缓冲液、稳定剂、辅酶、谷胱甘肽二硫、甲醛。

试剂2

缓冲液、稳定剂、氨基酸氧化酶、谷胱甘肽氧化酶、甲醛脱氢酶。

辅酶、氨基酸氧化酶、谷胱甘肽氧化酶、甲醛脱氢酶、谷胱甘肽二硫、甲醛在试剂1或试剂2中的位置可以不限。试剂(盒)可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。