[发明专利]2α-羟基取代白桦酮酸、其制备方法及其抗肿瘤用途

说明书

技术领域

本发明涉及生物药物领域，具体涉及2α-羟基取代白桦酮酸及其制备方法，本发明还公开了其抗肿瘤的用途。 

背景技术

当今临床使用的抗肿瘤药物中约40％药物来源于植物，其中白桦酮酸对多种肿瘤细胞具有显著的细胞毒活性，已成为抗肿瘤药物理想的筛选对象。但白桦酮酸的官能团较少，结构修饰的位点有限，主要集中在A-环和E-环的20-位及28-位，对其他位点的结构修饰报道较少。 

微生物转化是利用微生物产生的特异酶对外源性化合物进行结构修饰的特定生化反应。微生物体系中可产生多种酶，催化不同的生物转化反应。如氧化、还原、酯化、水解、环化、缩合及裂解等反应。生物转化具有高度的立体结构选择性，能专一地催化特定的反应，是天然活性化合物进行结构修饰的一种有效方法。 

发明内容

本发明公开了结构式I的化合物： 

命名为2α-乙酰氧基-白桦酮酸甲酯。本发明同时也包括结构式I的化合物的溶剂化物。2α-乙酰氧基-白桦酮酸甲酯的¹³C-NMR数据如下：

      表1 2α-乙酰氧基-白桦酮酸甲酯的¹³C-NMR数据 

药理试验证明，本发明的式I化合物具有优异的抗肿瘤效果。 

本发明的式I化合物优选用生物转化方法以白桦酮酸为底物进行转化制备，方法如下： 

为了寻找适宜转化白桦酮酸成2α-乙酰氧基-白桦酮酸甲酯菌种，本发明共筛选了多个菌种，结果发现，保藏号为NRRL5646菌种对白桦酮酸具有较强的转化能力(见表1)。 

筛选所用液体培养基：200克新鲜去皮马铃薯加沸水500ml煮15min后过滤，滤液加葡萄糖20g、KH₂PO₄3.0g、MgSO₄0.75g、Vb1 10.0mg，加蒸馏水定容至1.0L，加NaOH或HCl调pH值至6.0，150ml三角烧瓶每瓶分装30ml液体培养基，121℃、0.15MPa灭菌20min。 

筛选菌种时，保存菌种所用斜面培养基是在上述液体培养基加入1.5％的琼脂，15ml具塞试管每管5ml，121℃、0.15MPa灭菌20min冷却后制成。 

菌种的保存与活化：菌种活化采用两步活化法，参见：Nair，M.S.R.，andBasile，D.V.Bioconversion of artenium B to artmisinn.天然产物杂志(Jounal of Natural Products)1993，56(9)：1559。先将菌种接种于液体培养基，28℃180r/min旋转培养24-48h后，转接于另一液体培养基，接种量1-5％(V/V)，同条件培养24h后加样。

样品的制备及加样：白桦酮酸溶于乙醇，配成10.0mg/ml溶液备用；每瓶经两步活化的菌液(30ml)加0.5ml样品溶液，使每瓶菌液含白桦酮酸5mg。同条件培养120h后，中止反应，过滤菌体，发酵液用等量的乙酸乙酯萃取6次，合并萃取液、回收乙酸乙酯；得到萃取浸膏，菌体用乙醇提取3次，合并提取液，回收乙醇，得到提取浸膏，将两种浸膏和并，加少许乙酸乙酯溶解后备薄层鉴定用。 

空白对照：空白对照设阳性对照(底物+培养基)、阴性对照(培养基+菌)、溶剂对照(培养基+菌+乙醇)，培养和萃取条件同上。 

转化产物的薄层鉴定： 

薄层条件： 

1.薄层板：0.7％的CMC-Na制成的硅胶G板。 

2.展开剂：乙酸乙酯：石油醚(1：3)上行法展开。 

3.显色剂：10％硫酸乙醇溶液。 

操作： 

转化萃取物和空白对照萃取物分别点于薄层板，充分展开后取出自然晾干，喷以10％的硫酸乙醇，电吹风加热显色。转化结果见表1。 

         表1 微生物转化白桦酮酸筛选结果 

从筛选结果看，有四种菌可以转化，其中NRRL5646转化效果最好，经测算，转化率可达60％，而其余三种转率均较低，转化率不足0.5％。因此，本发明选用菌株NRRL.5646，以白桦酮酸为原料来制备2α-乙酰氧基-白桦酮酸甲酯。 

本发明公开了一种制备式I化合物的制备方法，用保藏号为NRRL 5646菌株对白桦酮酸进行生物转化获得。