[发明专利]产紫杉醇亮白曲霉菌及用其制备紫杉醇的方法

说明书

技术领域

本发明属于微生物生物技术、生物制药领域，具体涉及产紫杉醇亮白曲霉(Aspergillus candidus)及一株产紫杉醇亮白曲霉HUST-RBB3菌株，以及用其制备抗癌药物紫杉醇的方法。

背景技术

分离自红豆杉树皮的紫杉醇是目前国际上公认的重要抗肿瘤药物，但由于红豆杉资源的短缺，导致紫杉醇药源紧张。微生物发酵法生产紫杉醇是解决紫杉醇药源问题的最有效途径之一。微生物发酵生产紫杉醇具有易培养、易控制、生产成本低，可通过优化发酵条件等手段大幅度提高紫杉醇产量等优点，其大规模工业化生产比较容易实现，应用前景广阔。

自1993年Stierle等首次报道了从太平洋红豆杉树中分离到一种可产紫杉醇的内生真菌以来，国内外已有30多种可产紫杉醇的真菌报道。但是，目前发现的产紫杉醇真菌的紫杉醇产量都比较低，首次发现的安德鲁紫杉菌(Taxomyces andreanae)的紫杉醇产率只有24～50ng/L(Stierle et al.，1993，Science，260：214-216)。因此，需要提供新的紫杉醇产量高的菌株。

发明内容

本发明的目的在于提供一种产紫杉醇的亮白曲霉及用其制备紫杉醇的方法，该菌种的发明为通过微生物发酵法生产紫杉醇提供了新的菌株。

本发明提供的新的紫杉醇产生菌亮白曲霉HUST-RBB3已于2008年11月10日保藏于中国典型培养物保藏中心(China Center for Type CultureCollection，CCTCC)，该菌种保藏号为CCTCC No.M208209，分类命名为亮白曲霉(Aspergillus candidus)。

本发明的亮白曲霉HUST-RBB3菌株具有以下特征：在25～28℃温度下，在PDA(potato dextrose agar medium)平板上生长，两星期后菌落直径大约1cm，在CYA(Czapek yeast autolysate agar medium)平板上在可以达到4～5cm，而在37℃不能生长；菌落为白色，有光泽，菌落背面为浅黄色；菌丝直径约为5～8μm，分枝、有隔；分生孢子大小为2.5～3.5μm、白色、表面光滑、水珠型；具有特征性的孢子头结构，直径约为20～50μm，白色，球形；分生孢子梗约600～900μm，顶囊球形或近球形，小梗双层，在顶囊头部着生。详细的形态学特征和生理生化特征见图1和表1。

上述亮白曲霉HUST-RBB3发酵产紫杉醇可在18～32℃、pH4.0～8.0、需氧条件下进行。该菌株产生的紫杉醇，主要储藏于细胞中，一部分分泌于细胞外的培养基中。本发明提供的由发酵制造紫杉醇的方法，其特征在于：在培养基中培养亮白曲霉HUST-RBB3菌株以在其细胞内和培养基中聚集紫杉醇后，从其细胞内和培养基中提取紫杉醇。

在温度为25℃、180rpm振荡培养的条件下，野生亮白曲霉HUST-RBB3菌株在300ml土豆葡萄糖液体培养基中发酵10天，可以得到大约120μg/L的紫杉醇，是首次发现的产紫杉醇真菌安德鲁紫杉菌(Taxomyces andreanae)的紫杉醇产量(24～50ng/L)的2～5倍，是目前已报道在未优化培养条件下的紫杉醇产量较高的野生菌株。上述土豆葡萄糖液体培养基按下述配比和条件制备：马铃薯300g，葡萄糖30g，马铃薯去皮，切成块后用800ml蒸馏水煮沸半小时，然后用纱布过滤，再加葡萄糖，溶化后补蒸馏水至1L，自然pH值，121℃，灭菌15分钟后使用。

亮白曲霉HUST-RBB3菌株所产紫杉醇已经被本发明人证实，其结构和天然红豆杉植物中分离、纯化得到的紫杉醇标准品完全一致。

附图说明

图1为亮白曲霉HUST-RBB3的形态观察图，其中，(A)为CYA平板上的菌落，(B)为分生孢子头(光学显微镜镜)，(C)为分生孢子(电镜)。

具体实施方式

使用本发明提供的亮白曲霉HUST-RBB3菌株进行发酵培养可以制备紫杉醇，其发酵制备紫杉醇的优化方案为：

(1)将亮白曲霉HUST-RBB3菌株接种在PDA培养基平板上，25℃～30℃静置培养10～15天后，加入灭菌的蒸馏水，通过玻璃棉过滤器过滤收集孢子，用无菌生理盐水洗涤3～5次，然后用无菌生理盐水稀释至10⁶～10⁸个孢子/ml的数目。