[发明专利]一种油菜菌核病的早期快速分子检测方法

权利要求书

1.一种油菜菌核病的早期快速分子检测方法，其特征在于下列步骤：

(1)采集油菜花瓣：先将1.5ml Eppendorf管灭菌，将待测的随机取样于田间凋谢的油菜花瓣，按一片花瓣装入一个Eppendorf管，将采集的花瓣样本置于-80℃冰箱中冷冻；

(2)提取油菜花瓣总DNA：将装有油菜花瓣的Eppendorf管从-80℃冰箱中取出，迅速加入200μl抽提缓冲液，使之浸没过花瓣；用家用微波炉的低火档加热所述的样本，处理时间和顺序依次为20s，20s，15s，以样本不沸腾为宜；从所述微波炉中取出样本后立即再加入200μl抽提缓冲液；80℃水浴5min，中间轻轻摇晃一次；分别加入200μl苯酚和200μl氯仿，轻轻混匀；于12,000rpm离心10min，取上清液，加入800μl-20℃预冷的无水乙醇，轻轻混匀，静置沉淀20min；于12,000rpm离心10min，弃上清，取沉淀置于37℃下干燥约10min；加入15μl ddH₂O，37℃下静置约5min，沉淀溶解，得到油菜花瓣总DNA；

(3)巢式PCR反应：

第一次PCR：以ITS4/ITS5为引物进行第一次PCR，扩增反应体系为：PCR buffer，10pmol引物ITS4，10pmol引物ITS5，0.5U Taq DNA聚合酶，0.2mM dNTP，10μl步骤(2)制备的油菜花瓣总DNA，以ddH₂O补足25μl，将所述试剂加入后混匀，置于PCR仪内进行扩增；PCR反应参数为：95℃ 4min；94℃ 30s，50℃ 45s，72℃ 30s，30个循环；72℃延伸10min；

第二次PCR：以XJJ21/XJJ222为引物的第二次PCR，扩增反应体系为：PCR buffer，10pmol引物XJJ21，10pmol引物XJJ222，0.5U Taq DNA聚合酶，0.2mM dNTP，1μl第一次PCR产物，以ddH2O补足25μl；将所述试剂加入后混匀，置于PCR仪内进行扩增，PCR反应参数为：95℃ 4min；94℃ 30s，63℃ 30s，72℃ 30s，30个循环；72℃延伸10min；

(4)PCR扩增产物分析

取4μl第二次PCR扩增产物，加入1μl上样缓冲液，混匀，用0.5×TBE作为电泳缓冲液，在1.5％(w/v)琼脂糖凝胶中、5V/cm下电泳30min，用溴化乙锭染色15min后，在凝胶成相系统上成像；

(5)结果判定：将琼脂糖凝胶置于紫外光下，判定是否存在一条大小为292bp的目的条带；其中：

步骤(2)所述的抽提缓冲液配方为：2％十六烷基三乙基溴化铵(w/v)，2％聚乙烯吡咯烷酮(w/v)，1.4M氯化钠，0.1M，pH 8.0的三羟甲基氨甲烷-盐酸，0.02M乙二胺四乙酸；

步骤(3)所述的引物序列如下：

ITS4：5’-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3’；

ITS5：5’-GGA AGT AAA AGT CGT AAC AAG G-3’；

XJJ21：5’-GTT GCT TTG GCG TGC TGC TC-3’；

XJJ222：5’-CTG ACA TGG ACT CAA TAC CAA TCT G-3’；

步骤(4)所述的电泳缓冲液配方为：Tris 54g，硼酸27.5g，加入0.5M，pH8.0的EDTA20ml，定溶至1000ml；工作浓度为0.5×TBE。