[发明专利]丙型肝炎病毒核心抗原化学发光酶联免疫检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及病毒抗原检测试剂盒，尤其涉及一种丙型肝炎病毒核心抗原(HCV-core Ag)化学发光酶联免疫检测试剂盒及该试剂盒的制备方法。

背景技术

丙型肝炎是由丙型肝炎病毒(HCV)感染而引起的，主要经过血液传播。全世界有 1.7亿人感染了HCV，预计我国HCV感染者3800万，而且每年的新发病例数不断上升。 与乙肝相比，丙肝更容易转成慢性，约有70％的丙肝有可能发展成慢性肝炎，20％发展 成肝硬化，12％发展成肝癌，危害十分地严重。目前，慢性丙肝除了干扰素有确切的疗 效外，尚没有其它有效的治疗方法，而且疫苗的研制在短期内难有突破性的进展，因此， 早发现、早诊断、早治疗对于丙肝患者有十分重要的意义。

现在常用的HCV检测技术主要是抗体的检测和RNA的检测，但是各有缺陷。自1989 年，HCV抗体诊断试剂确诊出第一例HCV阳性感染者以来，抗体诊断试剂已经发展到了 第四代。尽管检测灵敏度在不断提高，但是窗口期(即从病毒感染起直到可以检测出该 病毒标志物之前的时期)仍然存在，这是输血安全的重大威胁之一。抗体检测也不能区 分感染活动期患者和病情康复者，不能用于患者的疗效监测；RNA检测分为定性和定量 两种，HCV RNA检测直接检测HCV病毒是否存在，其基本原理是逆转录聚合酶链反应 (RT-PCR)。虽然RNA检测可以早期诊断HCV感染，而且特异性好灵敏度高，但该方法 在设备和技术上要求较高，且人员需要专职培训，操作繁琐，假阳性高，因此难以在常 规工作和基层实验室中推广，限制了其应用。

HCV病毒核心抗原是HCV基因编码的结构蛋白之一，氨基酸序列十分保守，有研究 表明其在血清中的滴度与HCV RNA水平密切地相关，而核心抗原与RNA动力学变化密切 相关，因此可做为病程进展或抗病毒治疗的疗效监测的指标。HCV核心抗原的检测是一 新型的检测方法，研究始于上世纪九十年代中期，应用最广泛的是酶免疫方法。美国 Ortho公司已经推出了双抗体夹心法定性和定量检测血清样品中总的或游离的HCV核心 抗原ELISA试剂盒，于2004年已经在欧洲上市。中国仅有湖南景达制药有限公司于2005 年推出的核心抗原的ELISA检测试剂盒。但是HCV核心抗原的酶联免疫法灵敏度不高， 因此其推广使用也受到局限。所以发明一种既操作简便又灵敏度高的试剂盒具有非常重 要的临床意义。

发明内容

针对现有丙型肝炎抗体诊断试剂检测“窗口期”过长，且丙型肝炎抗原酶联免疫 检测试剂盒灵敏度不高的不足，为避免现有检测方法的局限性，本发明的目的在于提供 一种丙型肝炎病毒核心抗原化学发光酶联免疫检测试剂盒。

本发明所述丙型肝炎病毒核心抗原化学发光酶联免疫检测试剂盒，包括盒体，设在 盒体内的酶标板和设在盒体内的抗HCV-cAg酶结合物、HCV核心抗原标准品梯度溶液、 阳性血清对照、阴性血清对照、预处理液、HCV-cAg样品稀释液、化学发光底物液A、 化学发光底物液B、20×浓缩洗涤液及不干胶封片和使用说明书；其特征在于，所述酶 标板为乳白色不透明聚苯乙烯96或48孔化学发光酶标板，且其各孔包被有浓度为 5ug/ml的包被抗体Mab1和Mab2；所述抗HCV-cAg酶结合物是辣根过氧化酶标记的羊抗 兔的Mab3和Mab4抗体；所述标准品溶液为5个浓度梯度，分别是：20ng/ml、10ng/ml、 5ng/ml、lng/ml、20pg/ml；预处理液为体积比0.3％TritonX100、重量比1.5％SDS和 0.1M、pH8.0的Tris-HCL的混合液；化学发光底物液A是3.0mmol/L鲁米诺与0.3mmol/L 对碘苯酚的混合液，化学发光底物液B为7.5mmol/L的双氧水。

上述的包被抗体Mab1包含HCV核心区20～35氨基酸位置，Mab2包含HCV核心区 35～50氨基酸位置，Mab3包含HCV核心区100～115氨基酸位置，Mab4包含HCV核心区 115～130氨基酸位置。

本发明中，所述阳性血清对照为从HCV感染者静脉采血后分离的血清，其制备方法 是经EIA和分片段确认HCV四种(HCV-C、NS3、NS4、NS5)抗原均阴性；经PCR法测定HCV 为阳性，抗HIV、HBsAg亦为阴性，60℃水浴1小时后除菌过滤，-20℃保存；所述阴性 血清对照为正常献血员的血清，其制备方法是经HCV四种(HCV-C、NS3、NS4、NS5)抗 原分别检测均为阴性、抗HIV、HBsAg及TP亦为阴性的人血清，除菌过滤后-20℃保存。