[发明专利]QTL定位的原理

权利要求书

1.亲本选配

亲本的选配直接影响到所建群体的适用范围，一般应从三个方面对亲本进行选择：(1)亲本间的遗传差异，用于构建群体的亲本间的遗传差异，既不能过大，又不能太小，若差异过大，杂种染色体之间的配对和重组就会受到抑制，导致连锁座位之间的重组率偏低，造成严重的偏分离现象，降低所建群体的可信度，严重的还会导致杂交后代不育，影响群体的构建；若差异太小，亲本间DNA多态性就会比较低，使可用于QTL定位的多态性探针数量下降，影响定位的精度，亲本间的遗传差异与其亲缘关系有着密切关系，选配亲本时，其亲缘关系以多远为宜因物种而异，一般而言，异交作物的多态性高，自交作物的多态性低，如玉米的多态较好(Helentjaris et al.，1986)，一般自交系间就可构建理想的群体，而番茄的多态性极差，要选用不同种间的后代来构建群体；(2)亲本的纯度，选择亲本应尽量选用纯度高的材料，并进一步通过自交进行纯化，(3)选配亲本时还应对亲本及其F₁杂种进行细胞学鉴定，若双亲间存在相互易位或多倍分离群体材料存在单体或部分染色体缺失等问题，那么其就不宜用来构建分离群体。

2.群体类型

根据其遗传稳定性，目前QTL定位常用的分离群体可分为两大类：第一类称为临时性分离群体，如F₂、F₃、F₄、BC(backcross)、三交群体等。第二类称为永久性分离群体，如重组自交系(Recombinant inbred line，RIL)群体和加倍单倍体(Doubled haploid，DH)群体等。这些群体原则上还可用于质量性状基因的定位和分子标记连锁图谱的绘制(方宣钧等，2001)。

(1)F₂群体，F₂群体是由亲本杂交得到F₁后再自交得到的，除自交不亲和外，F₂群体容易配制，提供的变异类型最为丰富，能同时估计加性和显性效应，但F₂群体存在两个缺点，一是存在杂合基因型，对于显性标记，将无法识别显性纯合基因型和杂合基因型，因此会降低QTL定位的精度。而为了提高精度，减小误差，则必须使用较大的群体。二是不易长期保存，群体有性繁殖一代后，遗传结构就会发生变化，为了延长群体的使用时间，一种方法是对其进行无性繁殖，如进行组织培养扩繁，但这种方法并不适用于所有植物，且耗资费工，另一种方法是使用F₂单株的衍生系(F₃或F₄)，随机选取衍生系内多个单株，混合提取DNA以代表原F₂单株的DNA组成，这种方法只适用于那些繁殖系数较大的自花授粉植物(如水稻、小麦等)，且工作量大；

(2)BC₁群体，BC₁群体是由F₁与亲本之一回交产生的，BC₁群体中每一分离的基因座只有两种基因型，它直接反映了F₁代配子的分离比例，因而定位精度要高于F₂群体，此外，BC₁群体还可以用来检验雌、雄配子在基因间的重组率上是否存在差异，其方法是比较正、反回交群体中基因的重组率是否不同，例如正回交群体为(A×B)×A，反回交群体为A×(A×B)，则前者反映的是雌配子中的重组率，后者反映的是雄配子中的重组率，但BC₁群体与F₂群体一样，存在不能长期保存的问题，可以用F₂群体使用的类似办法来延长BC₁群体的使用时间，另外，该群体由于只有两种基因型，提供的信息量少于F₂群体，因此只能估计显性效应，不能估计加性效应，而且，对于一些人工杂交比较困难的植物，由于难以建立较大的群体和容易出现假杂种，BC₁群体也不太适合，对于一些自交不亲和的材料，可以使用三交群体，即(A×B)×C，由于存在自交不亲和性，这样的三交群体不存在假杂种现象，

(3)RIL群体，RIL群体是杂种后代经多代自交而产生，通常从F₂代开始，采用单粒传的方法来建立，由于自交的作用，群体中每个株系都是纯合的，因而RIL群体是一种永久性分离群体，可以长期使用，进行重复试验，因此特别适合于QTL定位研究。但该群体亦有两个不足，其一是异花授粉植物由于存在自交衰退现象，建立RIL群体比较困难，其二是相对于F₂群体，RIL群体的构建时间较长，理论上，建立一个通常使用的包含100-200个株系的RIL群体，必须自交多代才能达到完全纯合，为了节省构建时间，在实际研究中，人们往往使用自交6-7代的“准”RIL群体，从理论上推算，自交6代后，单个基因座的杂合率只有大约3％，已基本接近纯合，但由于涉及大量的DNA标记座位，因而虽然多数标记座位已达到或接近完全纯合，仍然有一些标记座位存在较高的杂合率，有的高达20％以上(李维明等，2000)，尽管如此，实践证明，利用这样的“准”RIL群体来进行QTL定位仍是可行的，

在RIL群体中，每一分离座位上只存在两种基因型，且比例为1∶1，从这点看，RIL群体的遗传结构与BC₁群体相似，也反映了F₁配子的分离比例。但RIL群体中两个标记座位之间的重组率比例并不等于F₁配子的重组值，这是因为在建立RIL群体的过程中，两标记座位间每一代都会发生重组，所以RIL群体中得到的重组率是多代重组率的积累，不过用RIL群体仍然可以估计重组率，亦即仍然可以进行QTL定位，

(4)DH群体，DH群体是由单倍体经过染色体加倍形成的，DH群体产生的途径很多，亦因物种不同而异，最常用的方法是取F₁植株的花药进行离体培养，诱导产生单倍体，然后对染色体进行加倍产生DH植株，DH植株是纯合的，自交即产生纯系，因而DH群体也是一种永久性分离群体，可以跟RIL群体一样，长期使用，重复试验，因此也特别适合于QTL定位研究，另外，由于DH群体的遗传结构直接反映了F₁配子的分离比例，因此DH群体跟BC₁群体一样，QTL定位的精度是最高的，

DH群体的建立所需时间不多，但产生DH植株有赖于花药培养技术，有些植物的花培非常困难，无法建立DH群体，另外，植物的花培能力跟基因型的关系较大，因而花培过程中会对不同基因型的花粉产生选择效应，从而破坏DH群体的遗传结构，造成严重的偏分离现象，这会影响QTL定位的精度，

上述两类分离群体各有其优缺点，临时性群体容易获得，而且能提供丰富的遗传信息，因此，早期QTL定位多用这类群体，但这类群体中分离单位是个体，一经自交其遗传组成就会发生变化，无法永久使用，很难进行多年多点重复试验，永久性分离群体虽然构建时间较长或难度较大，而且不能估计显性效应(无杂合基因型)，但这类群体中分离单位是株系，不同株系间存在基因型的差异，而株系内个体间的基因型是相同且纯合的，可通过自交或近交繁殖后代，而不会改变群体的遗传组成，可以永久使用，因此可以进行重复试验，减小误差，增加QTL检测的准确性，因而当今QTL定位越来越多地采用永久性分离群体(徐云碧等，1994)。

3.群体大小

QTL定位的精度，很大程度上取决于群体的大小，群体越大，则定位的精度越高，但群体太大，不仅增大实验工作量，而且增加费用，因此确定合适的群体大小是十分必要的，一般常根据两个方面来确定群体的大小：(1)研究目的：如果分离群体只是用于构建分子标记连锁图谱，则可以用较小的群体；如果用于定位控制重要农艺性状，尤其是数量性状的基因，则需要较大的群体；(2)群体类型：一般而言，F₂群体的大小必须比BC₁大约大一倍，才能达到与BC₁群体相当的精度，这是因为F₂群体中存在更多种类的基因型，为了保证每种基因型都有可能出现，就必须使用较大的群体，所以说BC₁群体的定位精度比F₂高，而DH群体的精度与BC₁相当，RIL群体则稍差，总的来说，为了达到彼此相当的QTL定位精度，所需的群体大小的顺序为F₂＞RIL＞BC₁和DH。