[发明专利]重组mtVEGF121/MAP30KDEL融合毒素的制备与应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域中的新生血管抑制剂，特别是涉及一种具有抑制新生血管形成作用的mtVEGF₁₂₁/MAP30KDEL融合毒素及其编码基因，与其在制备抗肿瘤、糖尿病晚期眼底血管增生以及类风湿性关节炎等多种涉及新生血管形成的疾病药物中的应用。

背景技术

近年来，新生血管抑制剂已受到人们的普遍关注。研究表明，只要抑制了新生血管形成或者破坏已有的血管网络，就能有效控制并治疗肿瘤、糖尿病晚期眼底血管增生以及类风湿性关节炎等多种疾病。在新生血管形成过程中，血管内皮细胞生长因子(VEGF)及其受体(VEGFR1和VEGFR2)发挥了关键作用，与肿瘤等多种疾病关系密切，尤其是VEGFR2在新生血管内皮细胞表面过度表达，而正常组织几乎无法检测到。因此，以VEGFR2为靶点设计的融合毒素将能有效破坏新生血管而不损伤正常组织，具有良好的临床应用前景和市场开发潜力。

迄今为止，新生血管抑制剂的主要应用领域为肿瘤血管靶向药物。在竞争激烈的世界抗癌药市场中，针对VEGFR2设计的肿瘤血管靶向药物近年来发展非常迅速，除了Avastin和Iressa已成功上市外，目前仍有几十种药物进入了临床试验阶段。这些药物按作用机理可分为作两类：一类是抑制肿瘤血管生成，如Avastin和Iressa，这类药物在肿瘤生长初期具有抑制效果，但对于发展到一定程度的肿瘤，只能阻止其进一步增大，不能达到缩小肿瘤的目的；另一类则是以VEGFR2为靶点的融和毒素，这类药物主要通过直接破坏肿瘤血管来控制肿瘤生长，是前者的重要补充。

发明内容

本发明提供了一种具有II型VEGF受体(Flk1/KDR)特异性，可特异性杀伤新生血管内皮细胞的融合毒素。

本发明所提供的具有选择性杀伤新生血管内皮细胞作用的融合毒素，名称为mtVEGF₁₂₁/MAP30KDEL，是通过连接肽在苦瓜籽的核糖体失活蛋白MAP30的氨基端(N端)连接mtVEGF₁₂₁得到的融合蛋白。

所述苦瓜籽核糖体失活蛋白MAP30是本发明的发明人从苦瓜籽中获得的一种分子量为30kD的核糖体失活蛋白，其氨基酸残基序列如序列表中SEQ ID NO：3所示，其编码序列可如序列表中SEQ ID NO：4所示。

所述人血管内皮细胞生长因子突变体mtVEGF₁₂₁基因是通过全基因合成获得的，其氨基酸残基序列如序列表中SEQ ID NO：1所示，其编码序列可如序列表中SEQ ID NO：2所示。

所述连接肽的选择是多种多样的，其氨基酸残基序列可如序列表中的SEQ ID NO：7所示的多肽，其编码序列可如序列表中的SEQ ID NO：8所示的核苷酸序列。

为获得更好的粗面内质网定位效果，所述融合毒素的C-末端还可携带有内质网定位信号KDEL，所述内质网定位信号的氨基酸残基序列如序列表中SEQ ID NO：9所示，其编码序列如序列表中SEQ ID NO：10所示。

所述连接肽也可替换为其类似物，这些类似物与所述连接肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其它已知的分子生物学技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸的类似物。

具体来讲，所述融合毒素mtVEGF₁₂₁/MAP30KDEL，是下述氨基酸残基序列之一：

1)序列表中的SEQ ID NO：5；

2)将序列表中SEQ ID NO：5的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加并具有杀伤新生血管内皮细胞作用的蛋白质。

序列表中的SEQ ID NO：5由393个氨基酸残基组成，自氨基端第1-121位氨基酸残基为mtVEGF₁₂₁；自氨基端第122-126位氨基酸残基为连接肽序列，自氨基端第127-389(263aa)位氨基酸残基为苦瓜籽核糖体失活蛋白MAP30；自氨基端第390-393(4aa)位氨基酸残基为粗面内质网定位信号KDEL。

编码上述具有破坏新生血管内皮细胞作用的融合毒素mtVEGF₁₂₁/MAP30KDEL的基因(mtVEGF₁₂₁/MAP30KDEL)，是下述核苷酸序列之一：